Universidad Autónoma de Coahuila
Facultad de Ciencias Químicas

Laboratorio de Bioquímica


Practica 6 pruebas para la identificación de aminoacidos

Objetivo: realizar las pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedades fisicoquímicas de aminoacidos y proteínas, así como su identificación.
Introducción
Las proteínas son macromoléculas de elevado peso molecular, ya que su estructura consta de cadenas de aminoacidos unidos por enlaces peptídicos entre un grupo alfa-carboxilo de un aminoacido y el grupo alfa amino del otro. Aunque en la naturaleza existen mas de 300 aminoacidos, en las proteínas solo se encuentran 20 que difieren en su tamaño, forma, carga, capacidad de formar puentes de hidrogeno o disulfuro y reactividad química. Las múltiples probabilidades de combinación de los veinte aminoacidos en las cadenas peptídicas, permiten la gran diversidad de las funciones proteicas. La presencia de grupos químicos ionizados en los aminoacidos permite a las proteínas presentar características fisicoquímicas específicas en el microambiente biológico. De ahí la importancia de su estudio. El objetivo de esta practica es realizar las pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedades fisicoquímicas de aminoacidos y proteínas, así como su identificación.

Material yreactivos:
* Parrilla de calentamiento eléctrica
* Matraces erlenmeyer de 125 ml
* Tubos de ensaye 13 x 100
* Pipetas de 1,5,10 ml
* Baño María
* Gradilla

* Solución de Ninhidrina al 0.2%
* Reactivo Biuret

* Solución de Glicina al 1%
* Solución de Fenilalanina al 1%
* Solución de Triptofano o triosina al 1%
* Solución de albumina de suero bovino al 2%

* Hidróxido de sodio al 40%
* Hidróxido de sodio al 10%
* Acido nítrico concentrado
* Acido sulfúrico concentrado
* Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
* Sulfato de cobre pentahidratado
* Yoduro de potasio
* Etanol al 95%

Preparar los reactivos como se indica:
Solución de Ninhidrina al 0.2%: disolver 0.2g de Ninhidrina en 10ml de etanol al 95% y completar a 100ml con agua destilada.
Reactivo Biuret: disolver en 25ml de agua destilada 0.75g de sulfato de cobre, 3g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado y 0.5g de yoduro de potasio (KI). Añadir con agitación constante 150ml de hidróxido de sodio al 10% diluir hasta 500ml con agua destilada y mezclar.
Procedimiento
Prueba de la Ninhidrina
Fundamento: la Ninhidrina reacciona específicamente con el grupo alfa-amino de los aminoacidos ya sean libres o bien unidos mediante enlace peptídico. la Ninhidrina a un pH entre 4 y8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con los grupos alfa amino para dar un compuesto coloreado que varia del azul violeta al purpura. Esta reacción también se conoce como condensación de la Ninhidrina.
Método
1. Enumerar 3 tubo de ensayo
2. En el tubo 1 colocar 1ml de agua destilada (blanco.)
3. En el tubo 2 colocar 1ml de la solución de Glicina al 1% (o cualquier otro aminoacido
4. En el tubo 3 colocar un ml de la solución de albumina de suero bovino al 2%.
5. Agregar a cada tubo 0.5ml de solución de Ninhidrina al 0.2%
6. Mezclar y colocar en baño María durante 5 min
7. Observar y registrar sus resultados

Prueba de Biuret
Fundamento: la prueba llamada Biuret nos sirve para investigar la presencia de enlaces peptídicos, unión especifica entre los aminoacidos de las proteínas. Se basa en la formación de sales complejas de color violaceo al añadir sulfato cúprico en solución alcalina. El complejo esta formado por enlaces de coordinación, donde los pares electrónicos proceden de los grupos amino de los aminoacidos de la cadena polipeptidica.
Método
1. Enumerar 3 tubos de ensayo
2. En el tubo 1 colocar 2ml de agua destilada (blanco).
3. En el tubo 2 colocar 2ml de la solución de Fenilalanina al 1% (u otro aminoacido
4. En el tubo 3 colocar 2ml de lasolución de albumina de suero bovino al 2%
5. Agregar a cada tubo 2ml del reactivo de Biuret.
6. Mezclar, observar y registrar sus resultados.
Reacción xantoproteica para la identificación de aminoacidos aromaticos.
Fundamento. Los aminoacidos que contienen anillos aromaticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) se someten a nitración, los compuestos nitroderivados son de color amarillo. La coloración amarilla se vuelve anaranjada con un tratamiento alcalino.
Método:
1. Enumerar 3 tubos de ensayo
2. En el tubo 1 colocar 1ml de agua destilada (blanco).
3. En el tubo 2 colocar 1ml de la solución de triptófano o tirosina al 1%
4. En el tubo 3 colocar 1ml de la solución de albumina de suero bovino al 2%
5. Añadir sucesivamente a los 3 tubos: 0.5ml de acido nítrico concentrado y posteriormente una gota de acido sulfúrico.
6. Colocar en baño María durante 5 minutos.
7. Dejar enfriar y agregar posteriormente 1 ml de hidróxido de sodio al 40%.
8. Observar y registrar sus resultados.

Observaciones
En la parte uno se noto como los compuestos a los que se les hacia la prueba cambiaban de color excepto el agua destilada. En la prueba 2 su cambio fue en todos pero solo en uno nos dio el color deseado un violaceo. Y en la prueba 3 el cambio fue el mas impresionant, ya que en uninstante uno solo había cambiado a un amarillo pero al mezclarlo fue impresionante como todo se hizo naranja, mientras que el ultimo tubo demostró como se había desnaturalizado la proteína y los aminoacidos que había desprendido se unieron facilmente a reactivo dandonos un color amarillo.
Resultados:
Parte 1
Reactivo y sustancia | observación |
Agua destilada + Ninhidrina | No cambio |
Glicina + Ninhidrina | Color azul intenso casi negro |
Albumina + Ninhidrina | Color azul muy obscuro |

Parte 2
Reactivo y sustancia | observación |
Agua destilada + Biuret | Color azul |
Fenilalanina + Biuret | Color azul tenue |
Albumina + Biuret | Color morado (violaceo) |

Parte 3
Reactivo y sustancia | observación |
Agua destilada + HNO3 +H2SO4+NaOH | Ningún cambio |
Triosina + HNO3 +H2SO4+NaOH | Color amarillo |
Albumina + HNO3 +H2SO4+NaOH | La albumina se desnaturalizo y lo aminoacidos formaron el color amarillo |

Conclusiones:
En efecto una vez mas pudimos comprobar lo dicho en la introducción y cumplimos satisfactoriamente el objetivo, demostrando como en todos los casos observamos la presencia de aminoacidos en dichas proteínas.
Preguntas
1. Describa el mecanismo de reacción de cada una de las pruebas ensayadas
2. investigue los métodos que se emplean para la secuencia de proteínas