Historia
La hidromiel es una bebida fermentada a base de miel y agua
muy típica de los vikingos.
La humanidad emplea la fermentación alcohólica desde tiempos inmemoriales para
la elaboración de cerveza (empleando cereales) y del vino (empleando
el fruto de la vid: la uva en forma de mosto) fundamentalmente. Los griegos atribuían el descubrimiento de la
fermentación al dios Dionisio. Algunos procesos similares como
el de la destilación alcohólica ya surgen en el año 1150 de la
mano de Arnau de Vilanova. Fue un elemento más a
considerar en el desarrollo histórico de la alquimia durante
la Edad Media.
En el año 1864 se identificó el gas CO2 resultante de la fermentación por
el químico MacBride y en 1766 Cavendish lo describió como:
'el gas existente en la atmósfera' determinando además la
proporción de dióxido de carbono con respecto al azúcar empleado en el proceso,
que rondaba el 57%. En esta época se empezó a descubrir,
gracias observaciones científicas, que la fermentación alcohólica se producía
también en substancias 'no dulces' Antoine Lavoisier hizo
experimentos en 1789 determinando las cantidades de los elementos
intervinientes en la fermentación (carbono, oxígeno e hidrógeno). Con
eladvenimiento de los descubrimientos químicos en el
año 1815 el investigador francés Joseph Louis
Gay-Lussac fue el primero en determinar una reacción de fermentación
obteniendo etanol a partir de glucosa, a pesar de este
logro los fundamentos de la fermentación alcohólica eran completamente
desconocidos. Existe durante el siglo XIX un debate
científico por establecer la hipótesis de la fermentación. Durante los
años 1830s los químicos Jöns Jakob Berzelius y Justus
von Liebig desarrollaron una teoría mecanicista que explica la
fermentación, teorías que estaban en contraposición con las creencias
de Louis Pasteur en el año 1857 que se fundamentaba en la
'teoría vitalista' como explicación de los mecanismo básicos de la
fermentación, fue el mismo Pasteur que en el año 1875 demostró que la
fermentación era un proceso anaeróbico (en ausencia de oxígeno).
En el año 1818 Erxleben, De La Tour en
Francia, Schwann y Kützing en Alemania (1837) descubren que
las levaduras (organismos microscópicos unicelulares) son la causa del proceso,
pero no fue hasta que Eduard Buchner en el
año 1897 descubre que la enzimazimasa es la responsable final de
la fermentación alcohólica trabajo por el que recibe el premio Nobel de
Química.7 Este descubrimiento atrajo el interés de otros científicos,
entre ellos Harden y Young quienes en el año 1904 mostraron que la
zimasa perdía sus propiedades fermentativas bajo condiciones de diálisis,
demostrando que la fermentación dependía de una sustancia de bajo peso
molecular que se quedaba retenida en los finos poros de la
membrana de la diálisis. La fermentación podía bajo estascircunstancias volver
a ser restablecida añadiendo simplemente de nuevo las levaduras, esta
substancia descubierta por Harden y Young se denominó cozimasa,8 y
fue eventualmente encontrada como una mezcla de iones
fosfatados, difosfato de tiamida y NAD+. Sin embargo la
caracterización de la cozimasa no fue completada hasta el año 1935. El
bioquímico Otto Heinrich Warburg en conjunción con Hans von
Euler-Chelpin descubren en el año 1929 que
el cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) juega un papel muy importante en el proceso interno de la
fermentación. Pronto en el año 1937 los investigadores Erwin
Negelein y Hans Joachim Wulff comprueban que mediante la
cristalización de los subproductos de la fermentación la
enzima alcohol deshidrogenasa es protagonista en algunos sub-procesos
realizando un papel importante.9
Los descubrimientos posteriores a partir del periodo que va desde mediados
del siglo XX hasta comienzos del siglo XXI se centran
exclusivamente en la mejora de los procesos de fermentación alcohólica y
conciernen más a la optimización del rendimiento industrial bien sea mediante
una buena selección de cepas de levaduras, de una temperatura de funcionamiento
óptima, de como realizar fermentación en un proceso continuo:
biorreactores.10 11
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Consideraciones generales
La fermentación alcohólica se puede considerar (desde una perspectiva humana)
como un proceso bioquímico para la obtención de etanol, que por
otras vías se ha obtenido gracias a procedimientos químicos industriales, como
por ejemplo mediante la Reacción de Reducción deetileno.La finalidad
de la fermentación etílica (desde una perspectiva microbiana) es la obtención
de energía para la supervivencia de los organismos unicelulares anaeróbicos.
Levaduras
La levadura S. cerevisiae (en una imagen demicroscopio) es un hongo unicelular responsable de gran parte
de las fermentaciones alcohólicas.
Las levaduras son cuerpos unicelulares (generalmente de forma esférica) de un tamaño que ronda los 2 a 4 μm y que están
presentes de forma natural en algunos productos como lasfrutas, cereales y verduras. Son
lo que se denominan: organismos anaeróbicos facultativos, es decir que pueden
desarrollar sus funciones biológicas sin oxígeno. Se puede decir que el 96% de
la producción de etanol la llevan a cabo hongos microscópicos,
diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran principalmente Saccharomyces
cerevisiae,Kluyveromyces fragilis, Torulaspora y Zymomonas
mobilis. Los microorganismos responsables de la fermentación son de tres
tipos: bacterias, mohos y levaduras. Cada uno de estos microorganismos posee una característica propia
sobre la fermentación que es capaz de provocar. En algunos casos son
capaces de proporcionar un sabor característico
al producto final (como
en el caso de los vinos o cervezas). A veces estos microorganismos no actúan
solos, sino que cooperan entre sí para la obtención del proceso global
de fermentación. Las propias levaduras se han empleado
a veces en la alimentación humana como un subproducto industrial. Se ha
descubierto que en algunos casos es mejor inmovilizar (reducir
el movimiento) de algunas levaduras para que pueda atacarenzimáticamente
mejor y con mayor eficiencia sobre el substrato de hidratos de carbono evitando
que los microorganismos se difundan facilitando su recuperación
(losbiocatalizadores suelen ser caros), para ello se emplean 'fijadores'
como agar, alginato de calcio, astillas de madera de
bálsamo, etcétera.
Algunas cepas de bacterias tienen eficiencias de fermentación altas sin
necesidad de fijación, incluso a relativas velocidades de movilidad, tal y como puede ser el caso
de Zymomonas mobilis (cuyo genoma completo se hizo público en el
año . Sin embargo, esta bacteria no se
ha empleado industrialmente para la fermentación de la cerveza y de la sidra
por proporcionar sabores y olores desagradables. No obstante posee una alta resistencia a sobrevivir
a concentraciones elevadas de etanol, lo que la convierte en una bacteria ideal
en la generación de etanol para usos no comestibles (como puede ser biocombustibles). El biólogo
Lindner en el año 1928 fue el primero en describir la
bacteria Zymomonas mobilis (conocida en honor de su descubridor
como Z. lindneri, Thermobacterium mobile o Pseudomonas
lindneri).16 Una de las características de esta bacteria es que emplea
la vía Entner-Doudoroff para el metabolismo de la glucosa, en lugar
de la más habitual vía de Embden-Meyerhoff-Parnas.
Cuando el medio es rico en azúcar (como puede ser el caso de
las melazas o siropes), la transformación del mismo en alcohol
hace que la presencia de una cierta concentración (generalmente expresada
en grados brix) afecte a la supervivencia de levaduras no pudiendo
realizar la fermentación en tal medio (las altasconcentraciones de azúcar
frenan los procesos osmóticos de las membranas de las células).
Aunque hay distintos tipos de levaduras con diferentes tolerancias a las concentraciones
de azúcares y de etanol, el límite suele estar en torno a los 14 o de
alcohol para las levaduras del vino, por ejemplo. Los
azúcares empleados en la fermentación suelen ser: dextrosa, maltosa,sacarosa y lactosa (azúcar de la
leche). Los microorganismos 'atacan' específicamente a
cada una de los hidratos de carbono, siendo la maltosa la más afectada por las
levaduras. Otros factores como el número de levaduras
(contadas en el laboratorio, o la industria, a veces mediante cámaras de
Neubauer).
Algunos enzimas participan en la fermentación, como puede ser
la diastasa o la invertasa. Aunque la
única responsable de convertir los hidratos de carbono en etanol y dióxido de
carbono es la zimasa. La zimasa es la responsable final de dirigir
la reacción bioquímica que convierte la glucosa en etanol. La idea de que
una sustancia albuminoide específica desarrollada en la célula de la levadura
llega a producir la fermentación fue ya expuesta en el año 1858 por Moritz
Traube como la teoría enzimática o fermentativa y, más tarde, ha
sido defendida por Felix Hoppe-Seyler hasta llegar al descubriemiento
de Eduard Buchner que llegó a hacer la fermentación sin la
intervención de células y hongos de levadura.
Bioquímica de la reacción
Bioquímica de la reacción de fermentación
La glucólisis es la primera etapa de la fermentación, lo mismo que en
la respiración celular, y al igual que ésta necesita
de enzimas para su completo funcionamiento. Apesar de la
complejidad de los procesos bioquímicos una forma esquemática de
la reacción química de la fermentación alcohólica puede describirse
como una glicólisis (en la denominada vía
Embden-Meyerhof-Parnes) de tal forma que puede verse como participa
inicialmente una molécula de hexosa:19
C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP → 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 +
2 ATP + 25.5 kcal
Se puede ver que la fermentación alcohólica es desde el punto de vista
energético una reacciónexotérmica, se libera una cierta cantidad de energía. La
fermentación alcohólica produce gran cantidad de CO2, que es la que
provoca que el cava (al igual que el Champagne y
algunos vinos) tengan burbujas. Este CO2 (denominado en la edad media
como gas
vinorum) pesa más que el aire, y puede llegar a crear bolsas que desplazan el
oxígeno de los recipientes donde se produce la fermentación. Por ello es
necesario ventilar bien los espacios dedicados a tal
fin. En las bodegas de vino, por ejemplo, se suele ir con
una vela encendida y colocada a la altura de la cintura, para que en
el caso de que la vela se apague, se pueda salir inmediatamente de la bodega.
La liberación del
dióxido de carbono es a veces 'tumultuosa' y da la sensación
de hervir, de ahí proviene el nombre de fermentación, palabra que
en castellano tiene por etimología del latín fervere.
Un cálculo realizado sobre la reacción química muestra que el etanol resultante
es casi un 51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el
7%.Se puede ver igualmente que la presencia de fósforo (en forma
de fosfatos), es importante para la evolución del proceso de fermentación. Lafermentación
alcohólica se produce por regla general antes que la fermentación
maloláctica, aunque existen procesos de fermentación específicos en los que
ambas fermentaciones tienen lugar al mismo tiempo. La presencia de azúcares
asimilables superiores a una concentración sobre los 0 g/L produce
invariablemente la formación de alcohol etílico en proceso de crecimiento de
levadura (Saccharomyces cerevisiae) incluso en presencia de exceso de oxígeno
(aeróbico), este es el denominado efecto Crabtree,21 este efecto es
tenido en cuenta a la hora de estudiar y tratar de modificar la producción de
etanol durante la fermentación.
Si bien el proceso completo (vía Embden-Meyerhof-Parnes) descrito simplificado
anteriormente explica los productos resultantes de la fermentación etílica de
una hexosa, cabe destacar que el proceso se puede detallar en una glicólisis
previa gobernada por un conjunto de enzimas en la que se obtiene
2 piruvato tal y como se describe a continuación:
C6H12O6 → 2 CH3COCOO− + 2 H2O + 2H+
La reacción química se describe como la reducción de dos moléculas
de Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+)
de NADH (formareducida del NAD+) con un balance final de dos
moléculas de ADP que finalmente por la reacción general mostrada
anteriormente se convierten en ATP (adenosín trifosfato). Otros compuestos
trazados en menores proporciones que se encuentran presentes tras la
fermentación son: el ácido succínico, el glicerol, el ácido
fumárico.
En más detalle durante la fermentación etílica en el interior de las levaduras,
la vía de la glucólisis es idéntica a la producida enel eritrocito(con
la excepción del
piruvato que se convierte finalmente en etanol). En primer lugar el piruvato se
descarboxila mediante la acción de lapiruvato descarboxilasa para dar como producto
final acetaldehído liberando por ello dióxido de carbono (CO2) a
partir de iones del hidrógeno (H+) y
electrones del
NADH. Tras esta operación el NADH sintetizado en la reacción bioquímica
catalizada por el GADHP se vuelve a oxidar por el alcohol
deshidrogenasa, regenerando NAD+ para la continuación de la glucólisis y
sintetizando al mismo tiempo etanol. Se debe considerar que el etanol va aumentando de concentración durante el proceso de
fermentación y debido a que es un compuesto tóxico, cuando su concentración
alcanza aproximadamente un 12% de volumen las levaduras tienden a morir. Esta es una de las razones fundamentales por las que las bebidas
alcohólicas (no destiladas) no alcanzan valores superiores a los 20% de
concentración de etanol.
Balance energético
La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico
exotérmico (libera energía) y moléculas de ATP necesarias para el
funcionamiento metabólico de las levaduras (seres unicelulares). Debido a
las condiciones de ausencia de oxígeno durante el bioproceso,
la respiración celular de la cadena del ADP en ATP queda
completamente bloqueada, siendo la única fuente de energía para las levaduras
la glicólisis de la glucosa con la formación de moléculas de ATP mediante
la fosforilación a nivel de sustrato. El balance
a nivel molecular del
proceso se puede decir que genera 2 moléculas de ATP por cada molécula de
glucosa. Si se compara este balance con el de
larespiración celular se verá que se generan 38 moléculas de ATP. A pesar de ello parece ser suficiente energía para los organismos
anaeróbicos. La energía libre de Gibbs (entalpía libre) de la
reacción de fermentación etílica muestra un valor de ΔG de -234.6 kJ
mol-1 (en un entorno de acidez neutra pHigual a 7) este valor
negativo de la energía libre de Gibbs indica que: desde el punto de
vista termodinámico la fermentación etílica es un proceso químico
espontáneo
Limitaciones del Proceso
La determinación de los factores que limitan la glicólisis fermentativa del
etanol son complejos debido a la interrelación existente y a la naturaleza de
los parámetros intervinientes durante el proceso de fermentación. Algunos de
ellos se deben tener en cuenta en la fermentación alcohólica industrial. En las
limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar algunos de los
más importantes como son:
* Concentración de etanol resultante - Una de las principales limitaciones
del proceso, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol
(alcohol) que se llegan a producir durante la fermentación, algunos
microorganismos como el saccharomyces cerevisiae pueden llegar a
soportar hasta el 20% de concentración en volumen. En ingeniería
bioquímica estos crecimientos se definen y se modelizan con las ecuaciones
de crecimiento celular dadas por las ecuaciones
de Tessier, Moser y de la ecuación de Monod.Acidez del
substrato - El pH es un factor
limitante en el proceso de la fermentación ya que las levaduras se encuentran
afectadas claramente por el ambiente, bien sea alcalino o ácido. Por reglageneral
el funcionamiento de las levaduras está en un rango
que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran
mantener los niveles óptimos de acidez durante la
fermentación usualmente mediante el empleo de disoluciones tampón. Los ácidos
de algunas frutas (ácido tartárico, málico) limitan a veces este proceso.
* Concentración de azúcares - La concentración excesiva de hidratos de
carbono en forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad
bacteriana. De la misma forma la baja concentración puede
frenar el proceso. Las concentraciones límite dependen del tipo de azúcar así como de la levadura responsable de la
fermentación. Las concentraciones de azúcares afectan a
los procesos de osmosis dentro de la membrana celular.
* Contacto con el aire - Una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el
denominadoEfecto Pasteur). Esta es la razón por la que los
recipientes fermentadores se cierren herméticamente.
* La temperatura - El proceso de fermentación es exotérmico, y las
levaduras tienen un régimen de funcionamiento en unos
rangos de temperatura óptimos, se debe entender además que las levaduras son
seres mesófilos. Si se expone cualquier levadura a una temperatura cercana
o superior a 55 °C por un tiempo de 5 minutos se
produce su muerte. La mayoría cumple su misión a temperaturas de 30 °C.
* Ritmo de crecimiento de las cepas - Durante la fermentación las cepas
crecen en número debido a las condiciones favorables que se presentan en el
medio, esto hace que se incremente la concentración delevaduras.
