FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
PROYECTO CURRICULAR DE INGENIERIA FORESTAL

LABORATORIO DE SILVICULTURA Y FITOMEJORAMIENTO

GUIA DE ENSAYOS DE POLINIZACION CONTROLADA Y CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE POLEN EN LABORATORIO.


MARCO TEÓRICO

La apertura de las estructuras florales externas es indicativa de la culminación de la gameto génesis y de la madurez de las estructuras que contienen los gametófitos. Excepto para aquellas especies en donde es predominante la auto polinización (Autógamas), la madurez de estas estructuras no es simultanea, de modo que el polen maduro es liberado de las anteras antes de que el estigma se encuentre maduro y receptivo (Protandria) ó el estigma madura y es receptivo antes de la liberación del polen (Protogínia).

El sinnúmero de especies de plantas han desarrollado a lo largo del tiempo evolutivo diferentes maneras o mecanismos de polinización, de modo que es posible hablar de especies anemófilas, cuando la dispersión del polen es producida por el viento -generalmente se trata de especies con flores inconspicuas ó sin ellas como en el caso de las gimnospermas- y de especies entomófilas, cuando la polinización ocurre a través del transporte del polen por los insectos. Algunas otras especies dependen de manera estrecha del accionar de melófagos superiores como colibríes y murciélagos.

Cuadro No.1 Caracteres comparativos entre especies alógamas y autógamas.
características que marcan de manera general la tendencia al cruzamiento o a la autogamia.
CARACTERÍSTICAS ALÓGAMA AUTÓGAMATipo de fecundación Cruzamiento Autogamia
Compatibilidad Autoincompatible Autoincompatible
Flores Muchas Pocas
Pedicelos Largos Cortos
Sépalos Grandes Pequeños
Corolas Radiales Tubulares
Pétalos Grandes Pequeños
Aromas Flores Aromaticas Flores sin aroma
Polen Muchos granos Pocos granos
Néctar Abundante Escaso
Pistilo Largo Corto
Longitud del estambre Mayor o menor que él pistilo Igual que el pistilo
Area estigmatica Bien definida Poco definida
Receptividad estigmatica y dehiscencia anteral Discordante Sincronizada
Ovulos por flor Muchos Pocos
Ovulos llegando a semilla Una parte Todos
Maduración de frutos Una parte Todos
Fuente: Ordnuf, tomado de https://www.apicultura.entupc.com, 2003
El condicionamiento o la imposición de barreras físicas y temporales a este proceso natural recibe el nombre de polinización controlada y su conocimiento, en su forma mas simple, probablemente se remonte a los inicios mismos de la agricultura y es uno de los procedimientos mas utilizados e importantes dentro del mejoramiento genético clasico ya que permite por ejemplo la hibridación específica y la polinización cruzada .

El conocimiento de la biología, fenología y fisiología floral así como de la madurez, viabilidad y germinación del polen son requisitos previos para su implementación en la mejora de una determinada especie.

Fenología floral

Su seguimiento debe hacerse por medio de un formulario adecuado, consignando por individuo datos como estado fenológico (floración, fructificación, estado vegetativo), abundancia relativa de yemas florales, botones y floresmaduras. El estado floral como tal debe seguirse tanto en campo como en laboratorio de modo que sea posible determinar por medio de características tales como tamaño, coloración, consistencia, etc., el momento en que se producira la apertura de la corola y por consiguiente se inician fenómenos tales como la antesis y la receptividad del estigma, con el fin de programar labores de emasculación y polinización.

Es posible ademas determinar mediante juiciosas y periódicas observaciones tanto en campo como en laboratorio, los periodos y duración de la antesis, número de anteras dehiscentes por flor antes, durante y después de la misma, sistema de polinización i.e., razón de número de granos de polen por flor / número de óvulos por flor(Cruden, 1977), agente polinizador, índice de fructificación(razón flores : frutos), etc.

Estudios mas amplios de la biología floral reproductiva cubren un amplio rango de temas, incluyendo mecanismos de incompatibilidad, polinización y biología de la semilla para lograr una comprensión completa (Bawa, 1985, citado por Bastidas y Hernandez, 2004).

Emasculación

Consiste en la eliminación de los estambres cuando aún no ha ocurrido el primer período de antesis, con el fin de evitar que se produzca la autopolinización en flores completas, de modo que el resto de la flor continua su desarrollo, por lo general protegida con una cubierta adecuada, hasta cuando el estigma se muestra receptivo, momento en el cual se procede a realizar la polinización manual. El principio de las técnicas de emasculación es basicamente el mismo: Eliminación de latotalidad de las anteras justo antes de la maduración del polen y de la dehiscencia da las mismas, con la mínima disturbancia posible sobre el resto de las partes florales, especialmente en cuanto al estilo y ovario. Sobre flores protóginas es valido emascular una vez se ha producido la apertura floral, sin embargo, si ademas de impedir la auto polinización se pretende inocular controladamente polen de un individuo en particular, es necesario al aislamiento de la flor (embolsado ó enfundado), antes de su apertura para evitar la contaminación con polen de individuos cercanos. Cuando se presenta el fenómeno contrario, y dado que es posible que sea muy corto el periodo entre la dehiscencia de las anteras (liberación del polen maduro) y la receptividad del estigma, lo que posibilitaría la pervivencia del polen sobre el estigma hasta que este último se torne receptivo, es necesario efectuar la emasculación antes de la apertura floral. Como en el caso anterior es necesario el aislamiento floral post emasculación, cuando se desee evitar la contaminación con polen de origen desconocido.

Aislamiento de flores

Puede tratarse de aislamiento de flores individuales o de grupos de flores, tanto completas o no. Su objetivo es impedir la polinización debida a los agentes naturales (viento, insectos u otros animales). Se usa un material adecuado para elaborar las coberturas, que permita el intercambio de gases, pero que impida el paso del polen. No se recomienda el uso de tul, a menos que presente orificios muy finos y se tenga la certeza de que el tamaño del polen de la especie esconsiderable. Comercialmente se encuentran bolsas a prueba de polen, con poros u orificios de diametro inferior a 1mm., con distribuidores como PBS Internacional Salter Road, sin embargo su consecución puede ser dificultosa por lo cual se recomienda usar materiales alternativos como “vinilpel” en el caso de polen muy pequeño ó “papel kraft” para polen de mayor tamaño; este último sin embargo tiene el inconveniente de no ser muy resistente a la lluvia.

Polinización manual

Consiste en la aplicación del polen directamente sobre el estigma de modo que se inicie el proceso de fecundación. Puede realizarse mediante la ayuda de un elemento como un pincel, por medio de artefactos especiales como “sprays”, aspersores y jeringas o mediante sacudido directo de las anteras maduras sobre el estigma.

Figuras 1 y 2. Ejemplos de polinizador y Pulverizador respectivamente.





Polinizador de ciclón armado
en CAMCORE, basado en los diseños Pulverizador usado par aplicar el polen.
de la Cooperativa NCSU-TIP y MeadWestvaco. sobre el medio de cultivo en el plato petri
Fuente: Tighe; CAMCORE, 2004Fuente: Alvarado, 2002






Cuadro No. 2 Ejemplo de Técnicas comparadas de polinización controlada en Eucalipto sp.



Viabilidad y germinación del polen

La viabilidad del polen hace referencia al porcentaje de polen de un total determinado que se encuentra en condiciones de germinar en un momento dado bajo condiciones favorables. Las pruebas comunes se basan en la tinción que exhiben los granos con actividad metabólica y por tanto vivos, ante diferentes reactivos. Los reactivos mas comúnmente usados para esta prueba son

• Tetrazolio, el cual mide la tasa respiratoria del grano.
• Tinción con Cotton Blue en Lactofenol y observadción al microscopio óptico.
• Otra técnica consiste en colorear granos de polen con cromato potasico férrico al uno por ciento en solución acuosa filtrada y estabilizada durante 24 horas a temperatura de laboratorio. La observación microscópica de una cantidad conocida de granos permite determinar los porcentajes de polen viable (coloreado de rojo) y no viable (no coloreados, blancos).
• acetocarmín al 1 %; el cual produce tinción diferencial de granos de polen viables y no viables

Por otro lado la geminación consiste en la formación del tubo polínico, estructura que se desarrolla desde el grano de polen hacia el saco embrionario, siendo el conducto a través del cual penetran las células espermaticas en este. Posado el grano depolen sobre el estigma encuentra un medio favorable suministrado por las secreciones del primero, que evita su desecación, condición indispensable para la germinación. La gran variedad de medios de germinación en laboratorio especialmente en cuanto a su composición, obedece al hecho de que se intenta imitar la composición de sustancias presentes en el humor del estigma ya que hipotéticamente estas juegan un papel decisivo en la formación del tubo polínico; sin embargo algunos autores consideran aún que su formación no obedece a factores de caracter químico en contraposición a aquellos que incluso sostienen que las sinérgidas incluso determinan la dirección de crecimiento del tubo polínico por medio de sustancias quimiotacticas.(Rutishauser, 1982)

De modo que se dispone tanto de una amplia gama de medios de germinación , como de componentes, a continuación se mencionan los mas comunes:

• Agua destilada
• Soluciónes de sacarosa a distintas concentraciones.
• Soluciones de glucosa a distintas concentraciones.
• Medio de cultivo con agar (1.2g) y sacarosa (11g) disueltos en 100 ml de agua destilada 35ºC x 2horas. Turner y Gilbanks (1974
• Agar con 5% de glucosa.
• Sacarosa 10gr, 30 mg de Nitrato de calcio (Ca(NO3)2.4H2O), 10mg de acido bórico(H3BO3), 20mg de sulfato de magnesio(MgSO4 7 H2O) y 10 mg de nitrato de potasio(KNO3) en 100ml de agua. (CABRERA, LUNA; GOMEZ SANCHEZ, M, 2003)

Cuadro No. 2 Ejemplo de medios y concentraciones de sacarosa para cultivo de polen

MEDIO CONCENTRACIONES DE SACAROSA(%)
5 10 15 20
Agua - - - -
Agua + 0.01% acido bórico+sacarosa X x x x
Agar 2.0+sacarosa X x x x
Agar 2.0+ Acido bórico 0.01%+sacarosa X x x x
Medio de Brewbaker-Kwack: sacarosa, acido bórico 100mg/l, nitrato de calcio 300mg/l, sulfato de magneriso 200mg/l, nitrato de potasio100mg/l, solución en agua destilada
na
x
na
na
Medio de Brewbaker-Kwack: sacarosa, acido bórico 100mg/l, nitrato de calcio 300mg/l, sulfato de magneriso 200mg/l, nitrato de potasio100mg/l, solución en agua destilada en agar
na
x
na
na
Fuente: Modificado de BASTIDAS, D.; LÓPEZ, F. ET AL, 2004 na: no aplica.

La caracterización morfología in extenso del polen requiere la aplicación de la técnicas como acetólisis que comporta el uso de preparaciones y equipos especiales. Sin embargo una observación mas general puede llevarse a cabo usando medios simples de tinción como

• Acetocarmín
• Glicerina
• Violeta de genciana
• Violeta de genciana en aceite de anilina

Que permiten la diferenciación de los granos y su facil observación bajo el microscopio óptico, especialmente útil para el polen de ciertas especies que puede lucir translucido y de difícil observación sin tinción adecuada o en su ausencia.

MATERIALES E INTRUMENTAL

• Piezas Florales en distintos estados de desarrollo
• Equipo de disección
• Cristalería ( Cajas petri, Vasos de precipitado)
• Papel filtro y secante
• Lupas

EQUIPO

• Estereo microscopio
• Microscopio óptico
• Camara fotografica
• Equipo microfotografía.

REACTIVOS

• Solución de tetrazolio blue al 1%
• Solución de tetrazolio 1%
• Souciones de sacaraosa al 5, 10 y 15%
•Solucione de acido bórico 0.01%
• Solución peróxido de hidrógeno al 3%
• Agua destilada
• Solución indigo carmín 10%

PROCEDIMIENTO

• Caracterización de piezas florales (estilo y anteras
• Observación de estado de desarrollo (Dehiscencia de anteras y receptividad de estigma)
• Obtención y montaje de polen para observación
• Descripción morfológica exterior del polen. Montaje con tinción por indigo carmín, tetrazolio y violeta de genciana.
• Montaje de viabilidad de polen (tinción con tetrazolio blue y normal y conteo sobre una muestra de 100 granos por dos repeticiones).
• Montaje de ensayos de germinación (dos medios , dos concentraciones y dos repeticiones)

BIBLIOGRAFÍA

• BASTIDAS, DAILY; LÓPEZ, F, ET AL. Biología reproductiva de Morrella Parvifolia Benth . Trabajo de investigación para optar al título de Ingeniero Forestal. Universidad Distrital. Bogota D.C. 2004
• CABRERA, LUNA; GOMEZ SANCHEZ, M. Algunos aspectos de biología floral de Mammilaria mathildae especie microendémica del estado de Queretaro en peligro de extinción. Universidad Autónoma de Queretaro. 2003

• CARABALLO H. Floral biology of guava (Psidium guajava L.) in Maracaibo
Plateau, Zulia, Venezuela. Rev. Fac. Agron. (LUZ). Departamento de Botanica, Facultad de Agronomía. La Universidad del Zulia.

• RUTISHAUSER, ALFRED. Introducción a ala emriología y anatomía de las angiospermas.Ed Hemisferio. Buenos Aires, Argentina. 1982

• TIGHE, MICHAEL; CAMCORE. Manual de Recolección y Manejo de Polen de
Pinos Tropicales y Subtropicales Procedentes de Rodales Naturales 2004.