Consultar ensayos de calidad


Centrifuacion Diferencial - Centrifugación en gradiente de densidad

Centrifugación Diferencial

Utilizada en fraccionamiento celular y subcelular.
Se basa en la diferencia de velocidad de sedimentación de partículas biológicas de diferente tamaño, forma y densidad. Esta diferencia debe ser grande para poder ser observada al centrifugar: Las partículas que posean densidades similares sedimentaran juntas. Este método es inespecífico, por lo que se utiliza como centrifugación preparativa para separar partículas de otros componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de núcleos y membrana) pero no es útil para separar moléculas. Se somete un homogeneizado a centrifugaciones repetidas aumentando cada vez la fuerza centrífuga.


Se logra así obtener las siguientes fracciones:
Núcleos, Mitocondrias, Lisosomas, Microsomas, Fracción soluble
Aplicaciones:
Eliminación de células procariotas en caldos de cultivo. Una manera bastante empleada en Bioquímica para obtener enzimas es el cultivo de bacterias en medios líquidos. Independientemente de que el enzima sea intra o extracelular, el primer problema con el que nos encontramos es la presencia de bacterias en el medio. La centrifugación del cultivo a 10.000 x g durante 20 minutos suele ser suficiente como para crear la fuerza centrífuga necesaria para sedimentar las células. Si el enzima es extracelular se descarta la pastilla bacteriana y se trabaja con el sobrenadante. Si se trata de un enzima intracelular habra que resuspender las células en un volumen adecuado, lisarlas y volverlas a centrifugar, buscando la actividad enzimatica en el sobrenadante (que se correspondera con el materialcitoplasmatico) o en el sedimento (membranas celulares).
 Precipitación de proteínas con sulfato amónico. La precipitación salina es una técnica muy empleada en purificación enzimatica; presenta un alto rendimiento pero muy poca selectividad, por lo que suele ser utilizada en las etapas iniciales del proceso. Las proteínas son polielectrolitos de superficie, por lo que al añadir al medio una sal, los iones de ésta neutralizan las cargas de las proteínas, llegandose a una situación en la que, por no presentar carga neta, las proteínas floculan. Para que la técnica tenga éxito es necesario recurrir a la centrifugación diferencial: el protocolo conlleva una centrifugación a 10.000 x g durante unos 60 minutos para que las proteínas que estan floculando en el medio precipiten.



 Tratamiento térmico. Algunas proteínas son mas termoestables que otras; si éste es el caso, un buen método para purificarlas es el tratamiento térmico. Las proteínas desnaturalizadas tienden a agregarse; una centrifugación diferencial ayudara a eliminarlas por sedimentación.

Centrifugación en gradiente de densidad.
   
Permite separar partículas de similar tamaño pero distinta densidad. Puede usarse sedimentación de velocidad o de equilibrio. En el primer caso se utiliza un gradiente de
sacarosa (separación de componentes en preparaciones de membrana).
En el segundo, cloruro de cesio (purificación de DNA).
Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrífuga. Consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se dispone por encima o se mezclacon un gradiente de densidad mas pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentración muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazara hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazara mas. Como consecuencia se produciran una serie de bandas discretas, las mas próximas  al fondo del tubo contendran las partículas con mayor densidad de flotación. Este método también se conoce como equilibrio en gradiente de densidad.  
Se emplean diferentes sustancias para conseguir los gradientes de densidad, como son sacarosa, percol, cloruro de cesio, etc. Los gradientes pueden ser autogenerados como es el caso de los basados en cloruro de cesio en que se forman en el propio proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la sacarosa o del percol. En este último caso la preparación se realiza antes de la centrifugación mediante un formador de gradientes, dispositivo que consiste en dos cubetas conectadas por la base y con agitación         en las que se colocan las soluciones con los dos extremos de concentración. A medida que se va sacando de una de ellas la otra reemplaza el líquido extraido y modifica linealmente la concentración.

Una alternativa es la centrifugación en gradiente discontinuo, en la que se crea un gradiente por etapas en el interior de un tubo al apilar sucesivamente volúmenes homogéneos de soluciones de diferente densidad. En las interfases de las diferentes capas se acumularanlas partículas que flotan (son menos densas) en la capa inferior pero que se hunden (son mas densas) en la capa superior.
        En la centrifugación por gradiente de densidad, la separación de una muestra se logra por sedimentación a través de un gradiente de densidad, esto es, una solución que incrementa en densidad desde la parte superior hacia la inferior del tubo de centrifuga. Dos aproximaciones distintas son posibles usando esta técnica; centrifugación zonal y centrifugación de equilibrio en gradiente.
La centrifugación de equilibrio en gradiente separa las partículas con base en sus densidades diferentes, la muestra puede ser cargada directamente sobre un gradiente de densidad preformado y la centrifugación llevada a cabo. Mientras en la centrifugación zonal la densidad del gradiente no debe exceder a la de las partículas a separar, en la centrifugación de equilibrio en gradiente la condición fundamental es que la densidad maxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partículas (1, 2).



La centrifugación de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idénticas, por lo cual también se le llama centrifugación isopícnica. En este punto no se producira una sedimentación posterior debido a que flotan sobre un 'colchón' de material que posee una densidad superior que la suya propia.
 Esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaño pero distintas en densidad. Puesto que la mayoría de las proteínas poseen casi la mismadensidad, este método no se suele utilizar para su separación. Sin embargo, en situaciones donde intervienen diferentes densidades, la centrifugación isopícnica es el método adecuado. Esto es cierto para moléculas, tales como acidos nucleicos, así como diferentes organelos celulares.
Existen 2 variaciones dentro de la centrifugación en gradiente de densidad:
Centrifugación de equilibrio en gradiente o isopicnica: esta técnica se emplea para separar partículas similares en tamaños pero distintas en densidad. Puestos que las proteínas poseen casi la misma densidad, este método no suele utilizar para su separación, sin embargo, en situaciones donde intervienen diferentes densidades, la centrifugación isopicnica es el método adecuado.
Centrifugación zonal: la muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrifuga las partículas comenzaran a sedimentar a través del gradiente, moviéndose cada partícula a diferentes velocidades dependiendo de su masa.

Conversion de RPM a Fuerzas G
Para convertir RPM a G utilizar:

FCR: fuerza centrifuga relativa
R: radio expresado en cm entre el eje de rotacion y el centro del tubo de la centrifuga
RPM: revoluciones por minuto

BIBLIOGRAFIA

http://www.dvs.com.ar/catalogos/catalogo-Gel.pdf
http://www.ehow.com/how_5018706_convert-centrifuge-rpm-rcf-_g_force_.html
http://www.scribd.com/doc/8304312/Metodos-de-Centrifugacion
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/CentriGradiente.htm
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm





Política de privacidad