UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLINICO
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR


Taller 1. Métodos de extracción de ADN


1. SALTING OUT
Método propuesto por Bunce M. Se basa en la lisis inicial de los glóbulos rojos mediante solución hipotónica y la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de las proteínas mediante precipitación salina (salting out) y extracción con solventes orgánico. Se utiliza cuando la cantidad de DNA requerido para un estudio es menor a 1 microgramo. Se distinguen 3 partes fundamentales del proceso: toma de muestra, extracción y purificación del DNA y precipitación y resuspención del DNA.

EXTRACCIÓN ORGÁNICA: FENOL-CLOROFORMO
La extracción orgánica de Fenol-cloroformo (abreviado PC o PERC) es una técnica de extracción líquido-líquido en bioquímica. Es ampliamente utilizado en la biología molecular para aislar el ADN, el ARN y las proteínas. Volúmenes iguales de fenol: mezcla de cloroformo y una muestra acuosa se a€‹a€‹mezclan, formando una mezcla bifásica. Este método puede tardar más que un sistema basado en columnas, pero tiene una mayor pureza y la ventaja de una alta recuperación de ARN. Fue realizado originalmente por Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi y publicado en 1987 (conocida como Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformextraction). Se vende por Sigma-Aldrich por el nombre de reactivo TRI, por Invitrogen bajo el nombre de TRIzol y Bioline como Trisure.
CROMATOGRAFIA DE PENETRABILIDAD
El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial, que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que originan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso. La técnica consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que sí son capaces de penetrar por los poros de la matriz.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero eluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, eluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

CHELEX

La extracción de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructurasque confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificación, que implica la retirada de la solución final de la mayoría de elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos críticos que componen el análisis de patógenos por PCR (Fig. 1), la extracción de ADN es quizás el más desconocido y sobre el que más control podemos ejercer. La extracción del ADN de las células o virus donde se halla confinado es un paso previo en muchos procedimientos analíticos y diagnósticos. Chelex®: resina de sílica que ayuda a separar selectivamente el ADN de la solución evitando la purificación de la muestra. Es un método rápido, pero muy poco eficaz en bacterias grampositivas.

BOILING
La extracción de plásmidos por calor (método de 'boiling' o de Holmes y Quigley) se utiliza para extraer ADN plasmídico de un gran número de muestras empleando pequeños volúmenes (minipreps). El ADN suele ser de calidad inferior al obtenido con otros métodos. Las bacterias se lisan tras tratamiento con lisozima, tritón y calor. El ADN cromosómico queda en la pared celular y se elimina por centrifugación. El ADN plasmídico queda en el sobrenadante y se precipita con isopropanol.
Para la extracción de plásmidos de mayor peso molecular se utilizan modificaciones de los métodos de lisis alcalina o de 'boiling' con un paso de purificación posterior o distintos métodos a gran escala que incluyen una lisis suave y purificación posterior del ADN con CsCl
2. Proteinasa K
Es una proteasa que se une al carboxilo de los residuos de hidrocarburos alifáticos, aromáticos o hidrofóbicosy se utiliza para digerir e inactivar DNasa y RNasa durante la purificación de ácidos nucleicos. La proteinasa K es una proteasa endolitica que está aislada de la familia de los hongos saprófitos Tritirachium. Tiene una gran actividad que es establece en un amplio rango de pH y temperatura y se adapta a los tiempos de digestión cortos. La actividad de la proteinasa K se incrementa a temperaturas elevadas de hasta 65 ° C. El calcio no es esencial para la función de la proteinasa K, por lo tanto, el EDTA y otros agentes quelantes no interfieran con la actividad y pueden ser utilizados junto con la proteinasa K para inactivar las nucleasas dependientes de calcio en el ADN y la preparación de ARN.
Lisozima
La lisozima es una enzima que se utiliza para romper las paredes celulares de las bacterias con el fin de mejorar la eficiencia de las proteínas o la extracción de ácidos nucleicos. Las lisozimas  son una familia de enzimas con actividad antimicrobiana que se caracterizan por la capacidad de dañar la pared celular de las bacterias. La enzima actúa catalizando la hidrólisis de los enlaces 1 beta entre el ácido N-acetilmurámico y  los residuos de N-acetil-D-glucosamina en peptidoglicanos y entre los residuos de  N-acetil-D-glucosamina en cito dextrinas. La lisozima es más eficaz para la lisis de la pared celular de  bacterias gram-positivas mas sin embargo también facilita la lisis de las bacterias gram-negativas, tales como Salmonella y Shigella. La lisis de E. coli es especialmente mejorada tras la adición de lisozima y nucleasas como DNasa I.
Sodio Dodecil Sulfato(SDS)
El sodio dodecil sulfato produce la desnaturalización de la proteína, que queda completamente desplegada y recubierta de moléculas de SDS, con carga negativa. El beta-mercaptoetanol es un agente reductor que rompe los puentes disulfuro, con lo que ayuda a la desnaturalización de las proteínas y además separa sus subunidades. El efecto conjunto de ambos es una separación de acuerdo únicamente con la masa molecular (la carga eléctrica resulta proporcional a la masa debido a la cubierta de SDS).
Tris HCl
Es una sustancia amortiguadora o buffer, generalmente se encuentra en solución,  es capaz de mantener su pH constante, a pesar de la adición de ácidos o bases fuertes y las influencias externas de temperatura, presión, volumen, potencial redox. Este buffer impide el cambio de la concentración de otra sustancia química, por ejemplo, donantes de protones y sistemas aceptores que impiden cambios marcados en la concentración de iones hidrógeno.
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA
El ácido etilendiaminotetraacético o EDTA es un compuesto orgánico que puede encontrar en estado sólido actúa como agente secuestrante de iones metálicos ya que posee gran afinidad por los iones metálicos debido a la cantidad de electrones libres que tiene esta estructura. Funciona como un extractor molecular para atrapar iones metálicos, se dice que es de acción secuestrante porque forma un complejo con los iones metálicos y forma compuestos muy estables llamados quelatos, tiene diversos usos entre ellos evitar la coagulación de la sangre al intervenir en los mecanismos de coagulaciónretirando el ion calcio necesario para que se lleve a cabo dicho proceso, se usa como antídoto en intoxicaciones por metales pesados y para retirar o hacer más solubles ciertos minerales en el agua.
Cloruro de sodio (NaCl)
El cloruro de sodio es utilizado en el proceso de extracción de ADN con el fin de que los iones de sodio (Na+) interaccionen con los grupos fosfato del ADN cargados negativamente. De esta forma los fosfatos no interaccionan con las moléculas de agua, ya que sus cargas negativas son neutralizadas por el sodio por ende el ADN se vuelve más insoluble, y de esta manera favorece su precipitación.
Fenol-Cloroformo
El fenol disocia las proteínas del ADN. El cloroformo desnaturaliza las proteínas y los lípidos y ayuda a mantener la separación de la fase orgánica y acuosa. También permite que el ADN menos soluble en fenol reduzca las pérdidas en la fase orgánica. El alcohol isoamílico se añade con frecuencia para evitar la formación de espuma. . Al ajustar el fenol a pH 5.6, el ADN se conserva en la fase orgánica mientras que el ARN se mantendrá en la fase acuosa.
Alcohol Isoamílico
El alcohol isoamílico estabiliza la molécula de ADN evitando que esta se lise y posteriormente precipita el ADN. 
Isopropanol
Líquido transparente, volátil e incoloro empleado en el laboratorio químico para extraer y disolver lípidos y en histología se usa como solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratándolo y llevándolo al fondo del tubo.
Etanol absoluto
El etanolabsoluto se utiliza para precipitar el ADN debido a sus propiedades de polaridad y solubilidad ya que dicho compuesto es soluble en agua pero insoluble en alcohol, lo cual causa que en presencia de este se precipite al ocurrir esta precipitación se puede observar la reacción.
Etanol 70%
El etanol limpia el ADN de otras biomoléculas tras un proceso denominado precipitación. En este proceso, el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean, y lo aísla de la solución acuosa para dejarlo libre de impurezas. Además, con la ayuda de sales de sodio, como el cloruro de sodio se logra facilitar el proceso de aislamiento del ADN y su posterior separación por centrifugación.
Bicarbonato de potasio
Buffer de lisis de glóbulos rojos.
Acetato de amonio
Buffer de lisis de glóbulos rojos.
Tris EDTA (TE)
Es una sustancia amortiguadora o buffer, generalmente se encuentra en solución,  es capaz de mantener su pH constante, a pesar de la adición de ácidos o bases fuertes y las influencias externas de temperatura, presión, volumen, potencial redox. Este buffer tiene como función proteger a los ácidos nucleicos frente a la degradación enzimática.
Acetato de sodio
Como base conjugada de un ácido débil, una disolución de acetato de sodio y ácido acético puede actuar como disolución tampón para mantener relativamente constante el pH. Esto es especialmente útil en la extracción de ADN y en el laboratorio de biología molecular donde las reacciones dependen del pH.
Columnas de afinidad e intercambio
Son mini columnas equipadascon una membrana de sílice que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis.
Bromuro de hexadeciltrimetilamonio 
Es usado como solución taponante para la extracción de ADN.
Chelex
Resina de sílica que ayuda a separar selectivamente el ADN de la solución evitando la purificación de la muestra. Es un método rápido, pero muy poco eficaz en bacterias grampositivas.
5 y 6Mediante un diagrama de flujo o un cuadro comparativo, explique como extraería el ADN en las siguientes muestras: hueso, un microorganismo, (bacteria o parasito) semen, cabello, una planta,y una mancha de sangre en un trozo de tela .Explique paso a paso como se logra la purificación y que componentes de la muestra debe ir eliminando hasta que el ADN queda puro.
3 y 4.


5 y 6.
Mx
Procedimiento
Hueso(*)
1. Eliminación de residuos carnosos e impurezas.
2. Lavar la muestra con detergente y tratarla con etanol.
3. Remover la médula con un Dremel (taladro).
4. Cortar del centro del hueso discos (en forma redonda, con centro hueco).
5. Cortar aparte con una Cizarra plana, para obtener pedazos más pequeños.
6. Pulverización de la muestra con un Freezer/Mill y posteriormente en tubos previamente irradiados con luz ultra violeta o debidamente autoclavados.
7. Ubicar en tubos plásticos de 50ml, 2grs de polvo de hueso.
8. Obtención de extractos.
8.1 Buffer de extracción por reacción; DTT 1M (4ml), EDTA 0.5M pH8 160 μL, SDS 10% 280 μL, Proteinasa K (10mg/mL) 200 μL.
8.2 Incubación con agitación; 56sC 2h, 50 μL de proteinasa K,56sC de 16 a 24h.
8.3 Centrifugación y recuperación del sobrenadante.
8.4 Desproteinización; PCIA 25:24:1.
8.5 Recuperación del ADN; precipitación de los ácidos nucléicos totales en presencia de acetato de sodio y etanol.
9. Cuantificación de ácidos nucléicos (ADN purificado).
Parásito(**)
(Partir de aproximadamente 100 ml de cultivo en fase logarítmica de crecimiento)
1. Centrifugar los parásitos a 4 000 r.p.m. durante 20minutos a 4sC.
2. Resuspender el botón de parásitos en 40ml de solución amortiguadora de fosfato (PBS) frío en un tubo de 50ml y centrifugar a 4 000 r.p.m. durante 20 minutos a 4sC.
3. Resuspender el precipitado en 1ml de PBS frío y centrifugar a 6 000 r.p.m. durante 5min a 4sC; repetir dos veces.
4. Resuspender el botón en 1ml de PBS frío y centrifugar a 13 000 r.p.m. durante 15 min
5. Resuspender el precipitado en 1ml de PBS frío y adicionar 100μL de NP40 al 10% en agua, mezclar y centrifugar a 13 000 r.p.m. durante 5 min a 4sC.
6. Resuspender el botón en 2ml de PBS, dividir en cuatro tubos y adicionar 50μL de SDS al 10% a cada tubo.
7. Adicionar 1 volumen de fenol equilibrado (550μL), mezclar, centrifugar por 10 min a 10 000 r.p.m.; recuperar la fase acuosa en otro tubo.
8. Extraer con un volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1, 275μL de fenol y 275μL de cloroformo-alcohol isoamílico), centrifugar a 10 000 r.p.m. durante 10 min y recoger la fase acuosa.
9. Extraer con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1, 550μL), centrifugar a 10 000 r.p.m. durante 10min; recuperar la fase acuosa.
10. Precipitar con 2 œvolúmenes de etanol absoluto (1 375ml), mezlcar hasta visualizar la madeja de ADN, tomar la madeja y pasarla a otro tubo.
11. Lavar la madeja de ADN con 1ml de etanol al 70%, centrifugar a 10 000 r.p.m. durante 5 min y descartar el sobrenadante.
12. Secar el ADN a temperatura ambiente (TA) o por incubación corta a 37sC.
13. Resuspender en 200-300μL de agua destilada y des-ionizada, según la cantidad de madeja obtenida.
14. Comprobar en gel de agarosa la calidad del ADN y cuantificarlo mediante espectrofotometría a 260nm (nanómetros
“…en caso de no obtener madeja, incubar toda la noche a -20sC y centrifugar por 1h a 4sC a 10 000 r.p.m. Guardar el sobrenadante y continuar con los pasos…”
“…todas las centrifugaciones deben hacerse a 4sC…”
Bacteria(***)
1. Lisis de las células; con ayuda de sales caotrópicas.
2. Adición del detergente SDS, (de ser necesario), para la eliminación de membranas.
3. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN, mediante la adición de una proteasa.
4. Purificación
4.1 Precipitación del ADN; con etanol frío o isopropanol y recuperar el sobrenadante por centrifugación.
4.2 Lavado del pellet; con alcohol frío.
4.3 Secar completamente el sedimento y luego de resuspender en agua o en tampón tris
5. Cuantificación de ácidos nucléicos (ADN purificado)
“…las suspensiones densas de bacterias gramnegativas, pueden liberar su ADN en condiciones bastante suaves…”
6. Eliminación de ARN;
Semen(*1)
(La muestra debe venir en un hisopo)
1. Cortar el hisopo e introducir el algodón en un tubo de 15ml estéril.
2. Añadir 3ml de aguaestéril y agitar en el Vortex cada 15 minutos durante 2h.
3. Transferir 1.5ml del volumen del tubo a un tubo eppendorf de 2ml
4. Centrifugar a 12 000 r.p.m. durante 5 minutos; eliminar el sobrenadante hasta dejar 50μL del precipitado.
5. Repetir los pasos anteriores hasta agotar el líquido del tubo que contiene el algodón.
6. Añadir 1ml de agua estéril al tubo que contiene el algodón y colocar en el Vortex; retirar el sobrenadante y repetir hasta dejar 40-50μL sobre el pellet.
7. Colocar una cestilla dentro del tubo eppendorf y centrifugar a 12 000 r.p.m. durante 10 minutos; (con el fin de aprovechar todo el líquido del algodón
8. Desechar la cestilla de algodón y eliminar el sobrenadante hasta dejar 40-50μL sobre el pellet.
9. Añadir 400μL de tampón de extracción y 20μL de proteinasa K (20mg/ml).
10. Mezclar e incubar a 56sC durante 2h.
11. Centrifugar 5minutos a 12 000 r.p.m. (con el fin de precipitar los espermatozoides); transferir el sobrenadante a otro tubo eppendorf y guardar a 4sC hasta la purificación de ADN.
12. Añadir al pellet 200μL de tampón de extracción y centrifugar 10 minutos a 12 000 r.p.m.; eliminar el sobrenadante y repetir tres veces los lavados dejando al final 50μL de volumen.
13. Añadir 400μL de tampón de extracción, 20μL de proteinasa K y 20μL de DTT 1M.
14. Agitar en el Vortex e incubar toda la noche a 37sC con agitación.
15. Añadir 200μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1).
16. Mezclar por inversión y centrifugar 3minutos a 12 000 r.p.m.; retirar el sobrenadante a otro tubo.
17. Añadir 200μL de cloroformo: alcoholisoamílico, mezclar, centrifugar 3minutos a 12 000 r.p.m.; retirar el sobrenadante a otro tubo.
18. Añadir a los espermatozoides 1ml de TE, centrifugar a 1 500 r.p.m. durante 30 minutos.
19. Decantar y secar a RT 10-15 minutos.
20. Resuspender en 50μL de agua estéril (ó TE).
Cabello; sin bulbo *1)

(Protocolo descrito por Singer-Sam et al (1998))
1. Añadir una porción mínima de 2 o 3cm del pelo, 200μL de Chelex (resina quelante con alta afinidad por iones metálicos polivalentes) al 5%, en un tubo eppendorf 1.5ml.
2. Añadir 20ng de proteinasa K y 7μL de DTT 1M; mezclar suavemente.
3. Incubar a 56sC entre 30 minutos y 1h.
4. Agitar en el Vortex a alta velocidad durante 5-10 segundos.
5. Microcentrifugar durante 10-20 segundos a 10 000-15 000 r.p.m
6. Hervir en un baño serológico durante 8 minutos.
7. Agitar en el Vortex a alta velocidad durante 5-10 segundos.
8. Centrifugar durante 3minutos a 10 000-15 000 r.p.m. antes de añadir la muestra a la mezcla de PCR.
Planta(*2)
1. Moler 1gr de tejido; en presencia de nitrógeno líquido.
2. Moler aproximadamente 2grs de tejido molido con 1000μL; recuperar todo en un tubo eppendorf de 1.5ml.
3. Centrifugar; 10 000grs 8minutos 4sC; eliminar sobrenadante.
4. Resuspender con 600μl; agregar 60 μl Proteinasa K
5. Incubar 65sC 15min; la temperatura puede variar.
6. Agregar 600μl de cloroformo: octanol 24:1, agitar hasta homogeneizar.
7. Centrifugar 7000g 12min 4sC; comprobar la transparencia del sobrenadante. Recuperar 200μl -250μl de sobrenadante en un tubo nuevo.
8. Agregar aproximadamente 600μl deIsopropanol frío –20sC.
9. Reposar 2hrs. a –20sC
10. Centrifugar 9,000g 5min 4sC; eliminar el sobrenadante.
11. Agregar 1000μl etanol 70% frío –20sC; reposar 5min a temperatura ambiente.
12. Centrifugar 7,000g 5min; eliminar sobrenadante.
13. Dejar secar completamente.
14. Resuspender.
Sangre seca en tela(*1)
(Se utiliza un método de extracción fenol-cloroformo especialmente diseñado para manchas de fluidos biológicos)
1. Cortar 1cm² y resuspenderlo 500μL de tampón DLB (Tris-C1H 1M, NaCl 5M, EDTA 0.5 M pH 8).
2. Añadir 50μL de SDS al 10% y 5μL de proteinasa K (20mg/ml).
3. Incubar toda la noche a 56sC con agitación suave.
4. Añadir 20μL de NaCl 5M y 575μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1); mezclar por inversión.
5. Centrifugar 3 minutos a 12 000 r.p.m. y pasar la fase acuosa a otro tubo.
6. Añadir 575μL de cloroformo: alcohol isoamílico y mezclar por inversión.
7. Centrifugar 3minutos a 12 000 r.p.m.; pasar el sobrenadante a otro tubo añadir 1ml de etanol absoluto frío.
8. Mantener durante 15minutos a -80sC y centrifugar 15 minutos a 12 000 r.p.m
9. Vaciar el contenido de los tubos y dejar secar el precipitado al aire.
10. Resuspender el precipitado ya seco en 50-100μL de agua bidestilada estéril e incubar a 56sC con agitación suave entre 2 y 16h
“…el rendimiento final es aproximadamente 35ng/μL…”

7. sbeadex® kit
LGC Genomics
Dentro de los parámetros de acción de kit se puede determinar una solución de lisis de células sanguíneas, razón por la cual, difiero que dentro de los reactivos que componen dicha solución de lisis se encuentran lalisozima, la proteinasa k y tritón.
8. Dentro de los pasos comunes para la extracción de ADN se encuentran:
Lisis de las células.
Degradación de la fracción proteica asociada a ADN.
Purificación
Precipitación del ADN.
Lavado de pellet.
Recuperación

9. An Optimized Protocol for DNA Extraction from Wheat Seeds and Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) to Detect Fusarium graminearum Contamination of Wheat Grain
Kamel Abd-Elsalam,1,2,3* Ali Bahkali,1,2 Mohamed Moslem,1 Osama E. Amin,1 and Ludwig Niessen4




BIBLIOGRAFIA
(*) DEL VALLE C. , RODRIGUEZ A. Y ESPINOZA M. Comparación de tres métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos. Complejo de ciencias forenses del organismo de investigación Judicial, Heredia, Costa Rica. Rev. Biol. Trop. 52 (3): 717- 725, 2004.
(**) Concepción J. Puerta B. y Claudia P. Ureña P. Practicas de Biología Molecular. Ed. Pontificia Universidad Javeriana. Colección Biblioteca del Profesional.
(***) La extracción y purificación del ADN para el análisis por PCR. Mitos y realidades. Newsletter Microbial. Informaciones sobre Análisis microbiológicos por PCR. Núm 3; Enero-Febrero 2009.
(*1) ÁLVAREZ IGLESIAS V. Estudio interdisciplinar de la variabilidad del ADN mitocondrial en poblaciones humanas. Tesis doctoral. Universidad de Santiago de Compostela. Facultad de medicina y odontología. Pág. 68-71
(*2) Alejandra Vázquez Lobo. 1996. “Filogenia de Hongos Endófitos del Genero Pinus L.: Implementación de Técnicas moleculares y Resultados Preliminares”. Tesis de Licenciatura. Facultad de Ciencias, UNAM.