PRACTICA - MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Introducción
Para procesos como la purificación de una proteína, el calculo de la actividad especifica de una preparación enzimatica o el diagnostico de enfermedades es necesario determinar la concentración de proteínas de la muestra biológica.
Para cuantificar la proteína hay distintos métodos. Estos métodos se suelen basar en tres cosas: la propiedad que tienen las proteínas de absorber luz en el UV, la formación de derivados químicos o la capacidad de las proteínas para unir algunos colorantes. Cualquier método que utilicemos necesita una solución estandar de proteínas.
En esta practica se han utilizado los métodos de Biuret y de Bradford.

Objetivo
El principal objetivo es que el alumno aprenda algunos métodos para la cuantificación de proteínas utilizando dos métodos diferentes. Se debe realizar una curva estandar para cada uno, determinar el rango de sensibilidad y cuantificar las muestras problema.
Materiales
-Tubos de ensayo
-Pipetas de automaticas regulables
-Espectrofotómetro
Teoría
Método Biuret
Esta basado en la formación de un complejo coloreado entre el cu +2 y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio basico (1 de cu+2 se une a 4 NH).La absorción maxima de este completo es a540nm.A mas cantidad de proteínas mas intenso sera el color, pocas sustancias interfieren en la reacción ya que es bastante especifica.
Proteína + (Cu+2)- Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Reactivos:
-Reactivo de Biuret
-Solución de seroalbúmina bovina (SAB) de 10.000 ppm en NaCl 0,15 N.
-Solución de SAB de 3000 ppm (M1) y 100 ppm (M2)
-Leche

Procedimiento:
Se hace una dilución de leche con agua de la cual se coge una fracción para hacer una segunda dilución. Se marcan los tubos con números del 1 al 15. En los 5 primeros tubos se diluye una solución concentrada de albúmina (10.000ppm), el volumen final es de 0,5 ml. En los tubos del 6 al 13 se viertes las muestras M1, M2, L1 y L2 por duplicado.
En los tubos 14 y 15 se prepara una solución como las de los primeros tubos pero se les añade EDTA(al 14) y SDS(al 15) para observar si afecta a la determinación de proteínas. En todos los tubos se añade 5 ml de Biuret, se agitan y se incuban. Finalmente se determina la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
El método tiene poca sensibilidad por lo que es conveniente usarlo para cuantificar proteínas en concentraciones altas.

Método de Bradford
Esa basado en la unión de un colorante hidrofóbico a las proteínas, mediante una relación inespecífica. En solución acidael colorante puede ser azul o naranja. Las proteínas se unen a la forma azul formando un complejo proteína-colorante. En su determinación interfieren pocas sustancias. Algunas de esas sustancias que si interfieren son los detergentes y las soluciones basicas (por la relación inespecífica).
Reactivos:
-Reactivo de Bradford:
-Solución de seroalbúmina bovina (SAB) de 250 ppm
-Solución de SAB de 3000 ppm (M1) y 100 ppm (M2)
-Leche

Procedimiento:
Es el mismo que en caso anterior, la diferencia se encuentra en que se añaden 5ml del reactivo Bradford en lugar del de Biuret. La absorbancia de cada muestra se determina a una longitud de onda de 595 nm.
Resultados y calculos
Método Biuret
Nº Tubo | SAB 10000 ppm (ml) | Agua (ml) | [SAB] ppm | Abs540 |
1 | 0 | 0,5 | 0 | 0 |
2 | 0,1 | 0,4 | 2000 | 0,04 |
3 | 0,2 | 0,3 | 4000 | 0,085 |
4 | 0,3 | 0,2 | 6000 | 0,108 |
5 | 0,4 | 0,1 | 8000 | 0,177 |

Curva de calibrado 1(Biuret):

Nota: la cuarta absorbancia medida probablemente no sea correcta porque el punto se aleja algo de la línea de tendencia de la grafica.
El R2 se refiere al cuadrado del coeficiente de correlacion.
Coeficiente de correlacion: 0,9892
Y= Absorbancia X= [SAB]
Conociendo la ecuación de la recta de calibrado y lasabsorbancias de M1 y M2 se puede calcular la concentración de M1 y M2

Nº tubo | Absorbancia | Concentraciones(ppm) |
6 | 0,064 | 3320 |
7 | 0,11 | 5620 |
8 | 0,0028 | 260 |
9 | 0 | 0 |
10 | 0,202 | 10220 |
11 | 0,208 | 10520 |
12 | 0,0107 | 655 |
13 | 0,0154 | 890 |

Media de las concentraciones (ppm) de los tubos duplicados:
6-7:4420
8-9:260
10-11:10370
12-13:772,5

Los tubos 6 y 7 contienen M1
Los tubos 8 y 9 contienen M2
Los tubos 10 y 11 contienen L1
Los tubos 12 y 13 contienen L2

El error cometido en M2 es pequeño ya que debería darme una concentración de 100 ppm y experimentalmente e obtenido una concentración de 260 ppm que aunque es algo mas alta se acerca bastante. Lo mismo ocurre con el valor de M1
Concentración (ppm) de proteínas en la leche:
L1:518.500
L2:1.931.250

Se multiplican las concentraciones por el factor de dilución.L1 se multiplica une vez ya que se a disuelto una vez y L2 dos veces.
Factor de dilución= Vfinal/Vmuestra= 0,5/0,1=50
Nº Tubo | SAB 10.000 ppm (ml) | Agua (ml) | EDTA 1M (ml) | SDS 20% (ml) | Abs540 |
14 | 0,2 | 0,25 | 0,05 | -- | 0,171 |
15 | 0,2 | 0,25 | -- | 0,05 | 0,082 |

De la misma forma se puede conocer las concentraciones (ppm) de los tubos 14 y 15:
14- 8.670
15- 4.220
El EDTA haelevado mucho la concentración con respecto al tubo 3 mientras que el tubo 15 con SDS se a mantenido con una concentración parecida ( algo mas alta) que la del tubo 3.

Método Bradford
Nº Tubo | SAB 10000 ppm (ml) | Agua (ml) | [SAB] ppm | Abs540 |
1’ | 0 | 0,5 | 0 | 0 |
2’ | 0,1 | 0,4 | 50 | 0,276 |
3’ | 0,2 | 0,3 | 100 | 0,398 |
4’ | 0,3 | 0,2 | 150 | 0,516 |
5’ | 0,4 | 0,1 | 200 | 0,588 |

Curva de calibrado 1’(Bradford):

Nota: Se han eliminado los puntos 2 y 5 cuyos valores de absorbancia son 0,276 y 0,588 respectivamente, por que se alejaban demasiado de la línea de tendencia lo que indica que experimentalmente no estan bien medidos.
Coeficiente de correlación=0,993
Nº tubo | Absorbancia | Concentraciones(ppm) |
6’ | 1,437 | 407,2 |
7’ | 1,407 | 399,2 |
8’ | 0,42 | 116,6 |
9’ | 0,38 | 105,2 |
10’ | 1,32 | 373,8 |
11’ | 1,313 | 371,2 |
12’ | 0,011 | -0,17 |
13’ | 0,026 | 4,11 |

Medias de las concentraciones (ppm) de los tubos duplicados:
6-7:403,2
8-9:110,9
10-11:372,5
12-13:1,97
Los tubos 6’ y 7’contienen M1
Los tubos 8’ y 9’ contienen M2
Los tubos 10’ y 11’ contienen L1
Los tubos 12’ y 13’ contienen L2

Las concentraciones se hallan sustituyendo en la ecuación de larecta.
Este método demuestra tener mayor sensibilidad ya que los valores de concentración experimentalmente se acercan mas a los valores que teóricamente debería obtener.

Concentración (ppm) de proteínas en la leche
L1: 18.625
L2:242.500
Se ha calculado de la misma forma que en apartado primero.
Nº Tubo | SAB 500 ppm (ml) | Agua (ml) | EDTA 1M (ml) | SDS 20% (ml) | Abs595 |
14’ | 0,2 | 0,25 | 0,05 | -- | 0,300 |
15’ | 0,2 | 0,25 | -- | 0,05 | 0,322 |

Concentraciones (ppm):
14-82,4
15-88,68
Se han calculado utilizando la ecuación de la recta.
Las concentraciones han descendido con respecto al tubo 3’.

Forma de hacer algunos calculos:
-La absorbancia se ha medido experimentalmente
- Las concentraciones se han calculado mediante los siguientes calculos
([SAB] en la disolución preparada * SAB utilizado) /Volumen final (0,5ml)
La [SAB] en la disolución preparada en el primer caso es 10.000 ppm y en el segundo caso es 250ppm.
Las opciones de Excel nos ofrecen la posibilidad de hallar la ecuación de la recta y el cuadrado del coeficiente de correlacion.
Cuestión 1
Biuret (ventajas)
Rapido
Es el método mas simple de analisis de proteínas
En la reacción Biuret pocas sustancias no proteicas interfieren
No se suele encontrar derivaciones decolor
Bradford (ventajas):
Método rapido, sensible y sin interferencias de cationes.
No hay interferencia del sulfato de amonio, puede medir proteínas o péptidos grandes.

Cuestión 2
Es una técnica espectrofotométrica que se basa en determinar la absorbancia a 280nm (en la región del UV), para obtener la concentración de proteína se hace una curva de calibrado.

Ventajas: no hay que usas reactivos, la muestra no se daña ni se destruye durante la determinación, alta sensibilidad.
Inconvenientes: Es un proceso en el que se pueden dar interferencias de compuestos que contengan anillos de purina y pirimidina. Hay que usar muestras limpias y lamparas bastante nuevas.
Cuestión 3
a) método de Warburg-Christian.
b) Biuret. Tiene poca sensibilidad por lo que es mas productivo en medios muy concentrados.
c) Bradford. Muestra interferencias con detergentes por lo que se puede saber que a la proteína se le ha hecho lisis con detergentes iónicos.