Producción de hígado graso con tetracloruro de carbono
Bioquímica

Objetivos
- Inducir hígado graso utilizando un modelo animal.
- Cuantificar los lípidos totales extraídos del hígado de los animales experimentales por medio de un método colorimétrico.
- Observar las diferencias de concentraciones de lípidos entre un animal normal y uno al que se le indujo hígado graso.

Procedimiento
Para la realización de este trabajo de laboratorio se utilizaron dos ratas hembras, de las cuales una fue inyectada intraperitonealmente con 0.5ml de una solución compuesta de tetracloruro de carbono y aceite mineral en partes iguales, tomando a la misma como rata experimental para la inducción de hígado graso, la segunda rata fue inyectada por la misma vía pero esta con 0.5 ml de aceite mineral y 0.5ml de suero fisiológico tomandola como rata control. 24 horas después las ratas fueron sacrificadas y se les extrajo a ambas el hígado, del cual se obtuvieron y pesaron pequeñas piezas que a continuación se maceraron en presencia de cloroformo-metanol (3:1) para extraer los lípidos.

Del extracto de lípidos se tomó una gota para llevar a cabo la hidrolización de los acil gliceroles en la solución utilizando para esto 0.2 ml de acido sulfúrico concentrado y calor por 10 minutos, luego de enfriar la solución se agregó fosfovainillina y se incubó a 37°C por 15 minutos, finalmente se leyeron en el espectrofotómetro a 540nm los tubos de las dos muestras (rata experimental ycontrol) obteniendo una absorbancia de 0.061 y 0.023 (respectivamente). La curva de calibración se preparó utilizando soluciones patrón de lípidos de 250, 500, 750 y 1000 mg/dl y utilizando el mismo método colorimétrico utilizado para la preparación de las muestras.

Resultados
Tabla No.1 Absorbancia concentración de lípidos en hígado de modelo animal
Muestra Absorbancia a 540nm Concentración mg/dl mg/g de hígado
Rata normal (control) 0.023 339 51
Rata con inducción de hígado graso (experimental) 0.061 565 167
Fuente: datos experimentales obtenidos en los laboratorios del departamento de bioquímica, T12 facultad de CC y QQ farmacia USAC
nm = nanómetros
mg = miligramos
g = gramos
dl = decilitros (100 ml)
ml = mililitro

Discusión de Resultados
La colina es el precursor de la fosfatidilcolina que junto con sus compuestos relacionados (fosfatidiletanolaminas y fosfatidilserinas) son los principales componentes de la fracción lipídica de las membranas y de las lipoproteínas de transporte. La deficiencia de colina puede ocasionar problemas hepaticos debido a la dificultad para el transporte de los lípidos dando como resultado una acumulación. La administración de tetracloruro de carbono provoca en el hígado la inhibición de síntesis de proteínas, inhibición de la síntesis intrahepatica y excreción de lipoproteínas y muerte del hepatocito, todo esto causa una acumulación de lípidos neutros en el hepatocito dando lugar al estado de hígado graso.
Laalteración del metabolismo por el tetracloruro de carbono es debida a la formación de radicales de triclorometano los cuales reaccionan con distintas biomoléculas provocando los efectos antes mencionados, es por estas razones que se utilizó para la inducción de hígado graso en el modelo animal.

Luego de extraídos los lípidos del hígado de la rata con la ayuda de maceración y una solución cloroformo-metanol (3:1) se hidrolizaron los acil gliceroles de dicha solución a lípidos libres utilizando acido sulfúrico concentrado y calor, a continuación se determinó la cantidad de lípidos por el método colorimétrico de Zöllner y Kirsch (ensayo de sulfofosfovainillina), para el cual se utilizó fosfovainillina (un aldehído aromatico) para la formación de un producto de color rojo que luego se leyó a 540 nm en el espectrofotómetro. Los datos de concentraciones de lípidos se obtuvieron a partir de las absorbancias por medio de una curva de calibración construida con patrones de soluciones lipídicas (Anexo 1).

Como se puede observar en la tabla no.1 la concentración de lípidos totales en el hígado de la rata normal (control) fue de 51 miligramos por gramo de hígado mientras que la concentración de lípidos en la rata a la que se le inyectó tetracloruro de carbono (experimental) fue de 167 miligramos por gramo de hígado, esto evidencia una clara diferencia causada por la alteración del metabolismo de la rata experimental, por lo que se puede inferir que se indujo un estado dehígado graso en la rata experimental.

Conclusiones
- Una deficiencia de colina causa la inhibición de la síntesis de lipoproteínas dando como resultado una acumulación de lípidos en el hígado.
- Los acil gliceroles puede ser hidrolizados a acidos grasos libres por la adición de acido sulfúrico concentrado y calor.
- Es posible determinar la cantidad de lípidos totales en una solución utilizando el método colorimétrico Zollner y Kirsch empleando fosfovainillina para la formación de un compuesto de color rojo.
- Es posible inducir un estado de hígado graso en una rata al inyectar por vía intraperitoneal una solución en partes iguales de tetracloruro de carbono y aceite mineral.
Referencias

Ramette, R. W. (1983). Equilibrio y analisis químico. México: Fondo educativo interamericano.

Jurado, Y. (2002). Técnicas de Investigación Documental. APA, MLA Y ML, México: Thomson.

Robert W. McGilvery. (1977). Conceptos bioquímicos. Barcelona, España: Editorial reverté, S.A.

Manuel A.S. Graca. (2007). Methods to Study Litter Decomposition. Holanda: Springer.

Anexos

Anexo no. 1 Curva de Calibración
Concentración de lípidos en solución inicial (mg/dl) Absorbancia a 540nm
Blanco 0 0
1 250 0.014
2 500 0.04
3 750 0.094
4 1000 0.136
Fuente: datos experimentales obtenidos en los laboratorios del departamento de bioquímica, T12 facultad de CC y QQ farmacia USAC
nm = nanómetros
mg = miligramos
g = gramos
dl = decilitros (100 ml
ml = mililitro