Diluciones para el recuento de viables en placa


Objetivos: Que los alumnos manejen correctamente el proceso de diluciones seriadas para poder determinar cuantitativamente el número de células viables de un cultivo.

Fundamento Teórico: Existe una variedad de métodos para numerar cuantitativamente a los microorganismos presentes en una muestra a analizar. Entre ellos se incluye el recuento directo mediante microscopio, uso de contadores electrónicos de células (Contador Coulter), métodos químicos para la estimación de la masa celular total o constituyentes celulares, mediciones turbidimétricas y el método de diluciones seriadas con recuento de viables en placa. Este último es una medida indirecta de la densidad celular y solo da información de bacterias vivas.

Considerando que una colonia bacteriana se desarrolla a partir de una única célula, la técnica de recuento de viables en placa permite determinar el número de bacterias o UFC (unidades formadoras de colonia) presentes originalmente en una muestra a analizar.
Para asegurar un recuento exitoso, el numero de colonias no debe ser mayor a 250, ya que las colonias estan demasiado cercanas una de otra como para distinguirlas claramente, ni menor a 25 colonias por razones estadísticas. Con el objeto de garantizar una cantidadaceptable de colonias se hacen diluciones seriadas de la muestra, y una alícuota de las diluciones se siembra en placas con medio de cultivo sólido. La posterior incubación de las mismas permitira el desarrollo de colonias que puedan contarse.
La técnica que utilizaremos implica esparcir el inóculo sobre la superficie del agar con ayuda de la espatula de Drigalsky.

Desarrollo experimental

1. Rotular los tubos de ensayos estériles desde 10-1 hasta 10-6.
2. Rotular las placas con agar nutritivo con el valor de la última dilución que se siembra (considerar el factor de dilución aportado por la alícuota que se toma de la última dilución).
3. Medir la DO a 600 nm de una alícuota del cultivo (considerar que una DO de 0 equivale aproximadamente 5.107 UFC/ml para los cultivos de E. coli). Estimar la concentración del cultivo inicial. Considerar que el volumen de la cubeta es 1 ml
El siguiente diagrama muestra un objeto irregular y un recipiente con 9 centímetros cúbicos de agua. La cantidad de agua debe ser la suficiente para que el objeto pueda ser sumergido en ella.
Se introduce el objeto en el recipiente y se mide el desplazamiento de agua que provoca

Al introducir el objeto al recipiente el agua subía su nivel marcando un volumen de 11 cm 3. Antes de introducirlo el volumen del agua marcaba 9 cm 3 por lo que la diferencia de volumen se debe al objeto.

El volumen del objeto se obtiene restando el volumen del agua, con el objeto, menos el volumen del agua sin el objeto:
 V    cm 3    -     9 cm 3    =    2 cm 3
Por lo tanto el objeto tiene un volumen de 2 cm 3.  
Estemétodo es bastante sencillo, pero es útil sólo para objetos pequeños que no absorben el líquido en el que son sumergidos. No es posible usarlo para medir el volumen de una piramide Egipcia, por ejemplo.
3. Material de laboratorio y Reactivos.
En la parte del calculo del volumen de un sólido no geométrico hemos usado los siguientes útiles de laboratorio:
* Probeta graduada.
* Frasco lavador.
* Una piedra como sólido no geométrico.
Y de reactivos :
* H2O.
En la segunda parte de esta practica hemos usado los siguientes útiles de laboratorio:
* Balanza de precisión.
* Probeta graduada en 100ml.
* Espatula.
* Vara de vidrio para agitar.
* Picnómetro.
* Frasco lavador.
* Pipeta de 5 ml
De reactivos:
* H2O.
* KCl
En la tercera parte usamos como material de laboratorio los siguientes útiles.
* Matraz aforado graduado de 500ml.
* Matraz aforado graduado de 250ml.
* Pipeta de 25ml.
* Balanza de precisión.
* Vaso de precipitados graduado de 250ml.
* Vidrio de reloj.
* Espatula.
* Frasco lavador.
* Embudo de vidrio.
* Varilla de vidrio.
De reactivos:
* NaOH.
* H2O.

4. Procedimiento experimental.
Para la primera parte de esta practica , obtención del volumen de un sólido rígido , hemos procedido de la siguiente manera. Lavamos una probeta con ayuda del frasco lavador y agua destilada . A continuación , enrasamos hasta cierta cantidad de agua , en este caso 150 ml.Después introducimos la piedra en dicho agua , el volumen ha cambiado (166ml) , esto es debido al volumen de la piedra , es decir, el volumen de la piedra sera igual al volumen de agua desalojado. Por tanto , el volumen de la piedra sera el producto del volumen final menos el volumen inicial.
La segunda parte , consiste en la averiguación de la densidad de una disolución de NaOH (19,745 g)y 80 ml de H2O. Para preparar la disolución se han cogido aproximadamente 20 g de NaOH en un vidrio de reloj con la ayuda de una espatula y balanza de precisión. Después en una probeta de 100 ml , se enrasa hasta el volumen de 80 ml , acto seguido se vierte el NaOH y se agita la disolución con una varilla de vidrio. Una vez preparada se usa el picnómetro graduado en 25 ml , se pesa el picnómetro vacío , y después lleno de agua destilada para comprobar la exactitud , una vez comprobada se procede al calculo de la densidad de la disolución.
En la tercera parte se prepara en primer lugar 500ml de una disolución 0’5 M de NaOH y H2O. Calculamos los gramos de NaOH que son necesarios para obtener esa disolución teniendo en cuenta la pureza al 98%. Una vez c Utilizar una cubeta con medio de cultivo sin inóculo como blanco.
4. Realizar los calculos para las diluciones seriadas las cuales permitan a partir de la siembra de 100 μl de la última dilución obtener entre 30 a 300 colonias.
5. Realizar las diluciones seriadas según los calculos.
6. Sembrar 100 μl de la última dilución por duplicado.
7. Incubar a 37ºC durante 24 – 48 horas.
8. Contar las colonias y realizar los calculos necesarios para obtener la concentración bacteriana en la muestra original.