OBJETIVOS
1. Determinar el espectro visible de una sustancia coloreada.
2. Comprobar experimentalmente la ley de Beer-Lamber.
3. Aplicar la ley de Bee-Lambert para determinar la concentración de soluciones coloreadas o muestra biológicas.
4. Realizar una curva de calibración.

PROCEDIMIENTO

1. Calibración del Espectrofotómetro con Blanco de Agua.
1. Verifique que el colorímetro este en modo de transmitancia y que la longitud de onda del inicio sea 400 nm.
2. Ajuste el equipo a 0% T girando suavemente la perilla izquierda.
3. Prepare un tubo blanco de 5 ml de agua destilada, introdúzcalo en la celda, ciérrela y ajuste al 100& T, con la perilla derecha.

2. Curva espectral del KMnO4.

1. En un tubo de vidrio agregue 5 ml de solución de KMnO4 2 x 10-4 M.
2. Lea la absorbancia de esta solución cada 10 nm en el rango de longitud de onda de 400 a 600 nm. No olvide calibrar cada vez que cambie de longitud de onda con el blanco de agua.
3. Registre sus datos en la tabla 2 y haga la grafica en el papel milimetrado de absorbancia vs. Longitud de onda. (Grafica 1)
4. Determine a cual longitud de onda el KMnO4 presenta la maxima absorbancia.

Tabla 2. Registro de los datos del espectro de KMnO4 2,5 x 10 -4M

|λ (nm) |A |% T |λ (nm) |A |% T |
|400 |0.085 |82.2 |510 |0.538 |28,8 |
|410 |0.070 |85.0 |520 |0.588 |25,8 |
|420 |0.045 |90.0 |530 |0.610 |24.0 |
|430|0.061 |86.6 |540 |0.600 |25.0 |
|440 |0.081 |83.0 |550 |0.526 |29,8 |
|450 |0.102 |79.0 |560 |0.436 |36,6 |
|460 |0.150 |70.6 |570 |0.343 |45,2 |
|470 |0.200 |63.2 |580 |0.231 |58,6 |
|480 |0.265 |54.2 |590 |0.150 |70,8 |
|490 |0.353 |44.4 |600 |0.105 |78,4 |
|500 |0.450 |35.6 | | | |

La longitud de onda donde el KMnO4 presentó la maxima absorbancia fue en 530 nm con una absorbancia de 0,610.

3. Curva de calibración KMnO4

Seleccione la longitud de onda donde el KMnO4 presentó mayor absorbancia. A partir de una solución de KMnO4 2 x 10-4 prepare los tubos del 1-5. No olvide calibrar antes el colorímetro con el Blanco. Para construir la curva de calibración debe calcular la concentración de cada patrón (Tubos 1-5) utilizando la fórmula ViCi=VfCf (anote sus calculos).

| |TUBO (ml) |
|SOLUCIÓN | |
||Blanco |1 |2 |3 |4 |5 |6 |
|H2O destilada |5 |4,5 ml |4,0 ml |3,5 ml |3,0 ml |2,5 ml |Muestra |
| | | | | | | |Problema |
|KMnO4 2,5 x 10-4M | |0,5 ml |1,0 ml |1,5 ml |2,0 ml |2,5 ml | |
|Transmitancia | |85,0 |74,0 |66,3 |59,0 |51,6 |62,2 |
|Absorbancia | |0,071 |0,118 |0,172 |0,227 |0,288 |0,173 |
|Concentración | |2,5 x 10-5 |5 x 10-5 |7,5 x 10-5 |1x 10-4 |1,25 x 10-4 |7,75 x 10-5 |

4. Curva de calibración de p-nitrofenol.
Utilizando una longitud de onda de 405 nm determine la relación en absorbancia y concentración y entre transmitancia y concentración:
Tome 5 tubos de ensayo marquelos con cinta de enmascarar y agréguele a cada uno las siguientes soluciones:

| |TUBO (ml) |
|SOLUCIÓN | |
| |Blanco |1 |2 |3 |4 |5 |
|Agua |1,5 ml |1,47 ml |1,44 ml |1,41 ml |1,5 ml ||
|Buffer pH 9,6 Barbital |1,5 ml |1,5 ml |1,5 ml |1,5 ml |1,5 ml |Problema |
|PNF 2,0 nM |----- |0,03 ml |0,06 ml |0,09 ml |0,15 ml | |
|absorbancia | |1,580 |1,640 |1,66 |1,73 |1.55 |
|Transmitancia | |2,6 |2,4 |2,2 |2,0 |2,8 |
|concentración | |2 x 10-2 |4 x 10-2 |6 x 10-2 |1 x 10-2 |2 x 10-3 |

Leer la serie de muestras en el colorímetro contra el blanco, anote sus datos en la parte inferior de la tabla. Ud. recibira una solución problema de PNF (P-nitrofenol) para que le determine la concentración a dicha muestra.

2. Concentración de la muestra problema de PNF= 2 x 10-3

5. De acuerdo a la longitud de onda maxima a qué color corresponde la absorción del KMnO4.
La longitud de onda es 530 nm y por lo tanto el color al que corresponde es Verde-Amarillento (520 - 550) y el color observado es el Violeta.

10. Investigue el método para la determinación de glucosa en sangre, y los valores normales en hombre y mujeres.

Método cualitativo: tiras colorimétricas.
La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimétricas. Este test usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de D-glucosa a acido glucónico con formación de H2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el H2O2 generado oxida un cromógeno (orto-dianicidina), produciendo un cambio de color, que indica la presencia de glucosa. Este método es específico para la glucosa y la detecta cuando suconcentración esta sobre el rango normal.

Método químico: o-toluidina.
La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehído de la glucosa para formar una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff correspondiente. Las reacciones que tienen lugar después de la condensación original producen una mezcla de cromógenos verdes con una longitud de onda analítica a 630 nm.

Método enzimatico: Trinder – 100 (Sigma).
El método enzimatico se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa
(GOD) por la β-D-glucosa. La enzima cataliza la oxidación de la glucosa por oxígeno molecular dando el D-gluconato y peróxido de hidrógeno (H2O2, agua oxigenada) (Rxn. 3.1). Para detectar y cuantificar esta oxidación se ocupa una reacción acoplada (Rxn. 3.2). En forma cuantitativa el H2O2 es oxidado por un reactivo comercial (4-aminofenazona (4-AF) y 4-hidroxibenzoato), reacción catalizada por la enzima peroxidasa, para dar como producto un compuesto coloreado rojo (quinonimina) que se cuantifica midiendo la absorbancia a 505 nm.

[pic]
• Valores normales
Los valores normales son entre 70 y 105 mg por decilitro.
En los niños pequeños se aceptan valores de 40 a 100 mg/dl.
Los valores mas bajos de 40-50 mg/dl se consideran bajos (hipoglucemia).
Los valores mas altos de 128 mg/dl se consideran altos (hiperglucemia).
Una persona tiene diabetes cuando el resultado del o los estudios muestran un resultado superior a 200 mg/dl.
Fuente
Laboratorios Alansa

8. ¿Qué importancia tiene realizar la curva de calibración en la clínica?

Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (porejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita.
En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la aparición de un color azul palido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de proteína dara lugar a que la solución se torne azul mas oscuro y así sucesivamente.[1]

11. ¿Por qué en pruebas clínicas es necesario utilizar un estandar o patrón?

PRUEBA DE ORO (GOLD STANDARD) 
Es la prueba o criterio utilizado para definir inequívocamente una enfermedad.
Es un diagnóstico prueba o prueba patrón que se mira como definitiva. Esta puede ayudar a diagnosticar un proceso de la enfermedad o los criterios por los cuales la evidencia científica es evaluada.
Ej.: biopsia, angiograma, necropsia posterior. 
Se construye sobre el supuesto de que aplicando ésta prueba es posible de tener el 100% de realizar un diagnóstico correcto.

COLORIMETRÍA Y ESPECTROFOTOMETRÍA

UNIVERSIDAD DEL VALLE – FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS

PRACTICAS DE LABORATORIO
FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA II

TERAPIA OCUPACIONAL

Semestre: Febrero - Agosto 2011

CECILIA DE PLATA, JOSÉ M. SATIZABAL, JULIO C. MONTOYA, M. MOSQUERA, GUILLERMO ORTEGA, MARTHA SOLÓRZANO

NOMBRE: CÓDIGO: PLAN:

Liseth G. Gonzalez T. 1040280 3651

----- ----- -------------
[1] https://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm

----- ----- -------------
[pic]