Cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina (CCF), TLC (Thin layer chromatography) es una técnica cromatografía. La fase estacionaria es una capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte.
En cromatografía en capa fina se utiliza una placa cromatografica inmersa verticalmente en un eluyente apolar; La placa cromatografica consiste en una fase estacionaria polar (comúnmente se utiliza sílica gel) adherida a una superficie solida con algún agente cementante. El eluyente debe ser un compuesto líquido apolar, generalmente organico. Para realizar la CCF, se debe apoyar la placa cromatografica sobre algún recipiente o camara que contenga la fase líquida a aproximadamente 1 cm (la distancia entre el principio de la placa y la muestra que se desea analizar). La cromatografía en capa fina es la combinación de todos los colores en un papel.

Aplicación de las muestras
Los productos a examinar se disolveran, cuando sea posible, en un disolvente organico que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación, lo mas común es usar acetona. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% deimpurezas.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedara la muestra a analizar. se anota en el cuaderno, no solamente en adsorbente empleado, sino la identidad del eluyente y la relación de los dos, o mas que se hayan utilizado.
Elección del eluyente
La elección del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo. Un método que se emplea para la selección del eluyente es una cromatografía en capa fina con distintos disolventes y unas muestras patrón.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad
Eter de petróleo
Eter dietílico
Ciclohexano
Acetato de etilo
Tetracloruro de carbono†
Piridina
Benceno†
Etanol
Cloroformo†
Metanol
Diclorometano
Agua
Acido acético
† compuestos cancerígenos.
En la elección del eluyente influyen varios factores
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy volatiles.
Evitar que contengan trazas demetales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
1. Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.
2. Aplicando un eluyente poco polar.
3. Aplicando un eluyente mas polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes mas polares, hasta dar con el mas apropiado.
Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera mas eficaz. la cromatografia
Desarrollo de la cromatografía
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la maxima saturación posible de la atmósfera de la camara, las paredes se impregnan del eluyente.
Generalmente el eluyente se introduce en la camara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega alos 30 minutos. El tiempo de una cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la mas conveniente para medir valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse rapidamente con una corriente de aire caliente.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
Localización de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos
Métodos químicos. Métodos físicos.
Métodos químicos Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes organicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que esconveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el acido sulfúrico, que reacciona con los componentes organicos produciendo manchas negras.
También es utilizado el permanganato potasico, que deja unas manchas de color amarillo. El tamaño de las manchas no esta relacionado con la cantidad de componente separado.
Ademas de estos reveladores generales, existen otros específicos
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). Verde de bromocresol (para acidos carboxílicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminoacidos).
Métodos físicos. El mas común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lampara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lampara de ultravioleta.

Cromatografía del papel

La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar unos analisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento.
La fase estacionaria esta constituida simplemente por una tira de papelfiltro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.
Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y se seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se veran las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro

Cromatografía en columna
Proceso mediante el que se separan y analizan una serie de sustancias en función de sus diferentes afinidades de absorción por un absorbente determinado, lo que se pone de manifiesto por los pigmentos depositados durante la filtración a través de un mismo absorbente colocado en un cilindro o tubo de cristal. Las sustancias se disuelven en un líquido que se pasa a través del absorbente, desplazandose a través de una columna a velocidades diferentes, dejando por detras una banda de pigmentos que se lava posteriormente con un solvente puro para 'revelar' las bandas que constituyen un cromatógrafo.