INTRODUCCION

La Cromatografía líquida de alta eficacia  (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y esta en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basandose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatografica. En la HPLC isocratica el compuesto pasa por la columna cromatografica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes mas utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el acido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos (1).

Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composiciónde la fase móvil durante el analisis, conocida como elución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos mas hidrofílicos eluiran a mayor concentración de agua, mientras que los compuestos mas hidrofóbicos eluiran a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos(2).

OBJETIVOS

• Conocer y manejar un equipo HPLC
• Determinar el contenido de cafeína en una muestra problema

MATERIALES Y METODOS

A partir de la solución stock de cafeína de 1000mg/L, se preparó, en matrazes volumétricos de 25 mL, un conjunto de 5 soluciones con concentraciones de 50 a 500 mg/L, las que se enrasaron con agua HPLC, para realizar la curva de calibración. Cada volumen se tomo con pipetas volumétricas y micropipetas.

Se extrajo una muestra de coca-cola, desgasificada, en un tubo ependorf como muestra problema, para medir su contenido en cafeína.

Se inyecta cada muestra, una a una, por medio de una jeringa Hamilton, evitando la formación de burbujas, en el equipo HPLC.

|fase móvil |CH3CN/Agua 20:80 |
|detector |UV a 270 nm |
|columna|RP-18 125x4 |
|flujo |1 ml/min |

TABLA 1: muestra las condiciones de cada componente, para el funcionamiento del equipo de HPLC.

RESULTADOS

En primer lugar se determina los volúmenes a usar para preparar cada muestra para la curva de calibración
|Muestra |Concentración mg/L |Volumen mL |
|1 |50 |1.25 |
|2 |100 |2.5 |
|3 |250 |6.25 |
|4 |350 |8.75 |
|5 |500 |12.5 |

TABLA 2: muestra las cantidades de volumen calculadas, para prepara cada muestra de concentración diferente, a partir de la solución stock de cafeína.

En segundo lugar se inyectaron en el equipo de HPLC, una a una, las muestras para la curva de calibración, registrando los siguientes datos

|Muestra mg/L |Tiempo de retención |Area |
|50 |2.03 |794653 |
|100|2.04 |1607595 |
|250 |2.08 |5413876 |
|350 |2.07 |8565462 |
|500 |2.09 |13055092 |

TABLA 3: muestra los valores obtenidos de los cromatogramas, en cuanto a tiempos de retención de las muestras y el area bajo cada peak.

[pic]
GRAFICO 1: muestra la curva de calibración, fabricada en base a los valores obtenidos en los cromatogramas de cada muestra a diferentes concentraciones de cafeína. Adema muestra la ecuación de la recta.

|Muestra |Area |Concentración calculada mg/L |
|Coca-cola |2551897 |128.89 |

TABLA 4: muestra los valores de Area del Peak de cafeína de la muestra de coca-cola desgasificada y el valor de concentración calculada, a partir de la ecuación de la recta de la curva de calibración.

DISCUSION

Como primera apreciación, se establece que el solvente para realizar la preparación de las muestras es agua HPLC, que es filtrada cuidadosamente ya que otro tipo de solvente podría contener partículas en suspensión, que pueden dañar los componentes del sistema de HPLC. Por ejemplo el oxigeno disuelto puede ocasionar interferencias en los detectores de fluorescencia o electroquímicos, el nitrógeno disuelto , cuando el solvente entra en el detector puede generar peaks falsos y desviaciones en la línea de base y eldióxido de carbono puede producir cambios en el pH del solvente(3).

Dentro de los mismos parametros, también se establece, la no presencia de burbujas en la jeringa de inyección de la muestra, ya que estas generan daño en las columnas de HPLC y variaciones en la línea de base.

De acuerdo a los valores obtenidos en los cromatogramas, se aprecian varios peaks, en vez de uno solo para cada muestra de cafeína, esto probablemente a fallas en el equipo, como obstrucción de la columna, o bien a partículas disueltas en la fase móvil, lo que causaría la aparición de peaks falsos. Por lo tanto, se determina que los peaks que presentan las mayores areas y tiempos de retención muy semejantes, comprenderían las señales de cafeína.

Por ultimo, al aplicar el valor del area del peak, que se presume es cafeína de la muestra de coca-cola, ya que comprende un tiempo de retención semejante al peak de cafeína, a la ecuación de la recta de la curva de calibración, se determina que corresponde a la concentración de 128.89 mg/L (ver tabla 4

CONCLUSION

Se determina que la concentración de cafeína en la muestra de coca-cola es de 128.89 mg/L.

La técnica de HPLC, resulta rapida y eficiente para la determinación de la concentración de un componente en una muestra desconocida.

REFERENCIAS

1. SKOOG, D. “Principios de analisis instrumental” 5a edición, Mc Graw Hill, Madrid 2001

2. HARRIS, D. “Analisis Químico Cuantitativo” 3era edición Editorial Reverté
2007.

3. https://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/hplc.htm

Universidad de Santiago de Chile
Facultad de Química y Biología

Cromatografía líquida de alta eficacia HPLC)

(Muestra de coca-cola desgasificada)

Nombre: Sophia Mejias
Fecha: 29/11/10