CLASES DE CROMATOGRAFIA
Tomando en cuenta el fundamento del proceso cromatografico, es decir,
dependiendo de la naturaleza química de las fases, de la muestra a
separar y de la interacción fisicoquímica que tendra lugar
entre ellos se cuenta fundamentalmente con dos clases o tipos de
cromatografía:
Cromatografía de Adsorción
En la cromatografía de adsorción la fase estacionaria sólida
posee un alto poder de atracción electrostatica (fuerzas de Van
der Waals) sobre los componentes de la muestra que se encuentran en la fase
móvil (líquida o gaseosa).
La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es
la forma clasica de la cromatografía de líquidos. Ha
sufrido algunas transformaciones que la han convertido
en un método importante de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo
de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la
primera la preferida.
En general la cromatografía
Líquido-Sólido es mas adecuada para muestras que son
solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en
disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de
reparto en fase inversa. En este tipo de
cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes
grupos funcionales. Una característica particular de este
método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en
mezclas.
Cromatografía de reparto
La cromatografía de reparto esta formada por la
cromatografía Líquido-Líquido. La fase estacionaria
líquida se encuentrasoportada en un
sólido inerte. La separación de una mezcla de sustancias se basa
en el reparto de los componentes entre la fase móvil y la fase
estacionaria, la cual se efectúa por diferencia de solubilidad entre las
mismas. En esta cromatografía se establece una
competencia entre las dos fases por las sustancias a separar. Esta técnica puede utilizarse en la separación de
mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes y bebidas refrescantes entre
otras.
El grado de separación de los componentes de una mezcla en cualquier
técnica cromatograficas depende de cuatro factores que son
1. Velocidad de flujo del
solvente. La velocidad es la misma para todas las sustancias presentes en la
mezcla.
2. Solubilidad de las sustancias en el solvente. No existen dos sustancias que
presenten la misma solubilidad en un determinado
solvente, en consecuencia, si la sustancia es muy soluble en la fase
móvil, tendera a movilizarse a través del
medio de sostén y aparecera al frente del solvente en movimiento. Si es poco
soluble tendera a permanecer mas cerca del punto de
origen.
3. Efectos de fraccionamiento (partición). Es la distribución que
presenta un soluto al estar en contacto con dos
solventes que no se mezclan. Solo puede obtenerse fragmentación completa
cuando se permite al soluto equilibrarse entre la fase estacionaria y la fase
móvil si esto no ocurre las bandas se ensanchan.
4. Efectos de adsorción. Si la concentración es muy alta la
superficie del
sólido (fase estacionaria)se satura y no se
alcanza el equilibrio. Ademas se deben evitar las impurezas ya que
tienden a ocupar los sitios de adsorción.
Los dos primeros factores son los responsables de la movilización de los
componentes de la mezcla a través del medio de sostén y los dos
últimos son responsables del retardo del movimiento de los componentes de la mezcla a
través del
medio de sostén.
CROMATOGRAFIA LINEAL IDEAL Y NO IDEAL
CROMATOGRAFIA LINEAL
Todos los procedimientos cromatograficos se basan en las diferencias en
el grado con el cual los solutos sufren partición entre la fase
móvil y la fase estacionaria.
Los equilibrios relacionados pueden describirse en forma cuantitativa por medio
de una constante dependiente de la temperatura, el COEFICIENTE DE PARTICION
“K”
K = Ce/ Cm Ce= Concentración de un soluto en la
fase estacionaria.
Cm= Concentración en la fase móvil.
Si toda la muestra se distribuye en una forma constante entre las dos fases, es
decir la razón de partición es constante, en una amplia gama de
concentraciones de soluto, se tendra la cromatografía lineal, es
decir, Ce es directamente proporcional a Cm. Pero con frecuencia hay relaciones
no lineales. Por ejemplo: a altas concentraciones de
soluto todos los lugares de absorción de la superficie del sólido estan ocupados, por
lo que la fase estacionaria ya no acepta mas soluto.
No se observan graves errores en los límites inferiores de
concentración, donde todas lascurvas son aproximadamente lineales. Se
considera solamente este tipo de cromatografía.
Condiciones para tener una Cromatografía lineal ideal
Lo ideal significa tener una separación completa.
1. Equilibrio instantaneo mantenido en todo el cromatograma en todo
momento.
2. Desplazamiento de las moléculas de la muestra en el cromatograma,
debido únicamente al movimiento de la fase móvil y sin
difusión en ninguna dirección en ninguna de las fases.
3. La proporción de fase estacionaria y fase móvil debe ser igual
en cualquier parte del
cromatograma.
CROMATOGRAFIA NO IDEAL
Los picos cromatograficos se ensanchan por lo general debido a tres
procesos. Las magnitudes de estos efectos estan determinados por
variables controlables tales como:
la velocidad de flujo, el tamaño de partícula del material de empaque, las velocidades de
difusión y el grosor de la fase estacionaria.
Parametros que rigen el ensanchamiento de las bandas
1. Difusión en remolino (Ordinaria): El ensanchamiento de zona se debe a
la gran cantidad de trayectorias que puede encontrar una molécula en su
camino a través del
empaque de una columna. Las longitudes de estas trayectorias
no son iguales, en consecuencia, los tiempos de residencia de las
moléculas de la misma especie en la columna también son
variables. El ensanchamiento puede relacionarse con el tamaño de
las partículas, la geometría y lo compacto del empaque de la
fase estacionaria, es independiente de la velocidad de flujo. Elensanchamiento
de las bandas debido a la difusión en remolino, disminuye al
mínimo si se empaca cuidadosamente la columna con pequeñas
partículas esféricas cuyo tamaño varía dentro de un intervalo determinado. Es necesario
tener especial cuidado en evitar la formación de canales abiertos.
Se considera que en las columnas cuidadosamente empacadas, el
ensanchamiento de las bandas debido a la difusión en remolino puede ser
mínimo.
2. Difusión Longitudinal o molecular: Se debe a la tendencia de las
moléculas a migrar desde la porción central concentrada de una
banda hacia las regiones mas diluidas a ambos lados de ella. Esto produce un
ensanchamiento de las bandas. El ensanchamiento puede
reducirse aumentando la velocidad de flujo.
3. Transferencia de masa entre fases (fuera del equilibrio): Las bandas
cromatograficas se ensanchan también debido a que el flujo de la
fase móvil es por lo general tan rapido que no se puede alcanzar
un verdadero equilibrio entre las fases, que debe ser instantaneo,
entonces la cola de la zona se estira mas de lo que ocurriría si
el tiempo fuera suficiente para lograr el equilibrio. Estos efectos se hacen
menores a medida que disminuye la velocidad de flujo, debido a que hay
mas tiempo disponible para que se alcance el equilibrio. Se espera un mejor equilibrio si los canales a través de los
cuales fluye la fase móvil, son estrechos de modo que las moléculas
del soluto no
tengan que difundir a lo largo de una distancia grande para alcanzar lafase
estacionaria. Por la misma razón las capas de líquido
inmovilizado en la fase estacionaria deben ser lo mas delgadas posible.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA EFICIENCIA DE LAS SEPARACIONES
CROMATOGRAFICAS
1. FASE ESTACIONARIA O SORBENTE: Se conocen también como ADSORBENTES, aún
cuando su empleo puede ser indistintamente para cromatografía de
Adsorción o de Partición y como
se sabe existe una gran variedad de ellos. Los sorbentes mas
comúnmente empleados son de mayor a menor actividad: OXIDO DE ALUMINIO
(ALUMINA) > SILICA GEL > CARBON ACTIVADO > TIERRA SILICIA (KIESELGUHR)
> CELULOSA > POLIAMIDA > RESINAS DE INTERCAMBIO IONICO.
La regla general para la elección del adsorbente en
Cromatografía por Adsorción, es emplear adsorbentes poderosos
(activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos actividad para
sustancias mas polares.
Características de los sorbentes
1) Tamaño de la partícula: Puede variar de unas cuantas micras
hasta 150 0 mas micras. Para cromatografía en capa fina las partículas son
mas finas (< de 40 micras) que para cromatografía en columna.
En columna se utiliza partícula gruesa (40 micras o
mas) para facilitar el corrido de la muestra y el solvente.
2) Homogeneidad: Entre mas homogéneas sean
las partículas de la fase estacionaria se obtendra una mejor
separación.
3) Pureza: Deben estar lo mas puros posibles. El agua se considera una
impureza en cromatografía por Adsorción, por lo que es necesario
eliminarla antesde realizar el desarrollo, a este
proceso se le conoce como
Activación.
2. FASE MOVIL O SOLVENTE. Es la responsable del arrastre de los
componentes de la muestra. Puede ser líquida o gaseosa
y se obliga a pasar a través de la fase estacionaria por capilaridad,
gravedad o presión. Debe interaccionar con los componentes de la
muestra para poder separarlos. Puede ser una sustancia o
mezcla de dos, tres e incluso cuatro líquidos de polaridad diferente.
Sus características mas importantes son
a) Pureza
b) Calidad
c) Poder de elución: Esta en función de la polaridad del solvente, entre
mas polar se considera con mayor poder de elución.
La regla para elegir el solvente es: elegir la polaridad del disolvente
analoga a la de la muestra a emplear. Se puede
realizar la Prueba del poder de elución.
Ademas se tomara en cuenta el tipo de cromatografía que se
efectuara: reparto o adsorción. Con adsorbentes como Alúmina o gel de sílice la
intensidad de la adsorción aumenta al crecer la naturaleza polar del material adsorbido, por lo que en estos casos se
emplea un disolvente apolar como
el éter de petróleo.
Los solventes usados en cromatografía de reparto son compuestos
organicos saturados con agua, en algunos casos se le adiciona poca
cantidad de agua para que los compuestos muy polares se muevan lentamente y
obtener una mejor separación.
DISOLVENTES POR ORDEN DE MENOR A MAYOR PODER ELUYENTE
Hexano, éter de petróleo < Heptano < Ciclohexano <
Tetracloruro de carbono
