BOTANICA
PROPAGACION IN VITRO DE CAOBA (Swietenia macrophylla KING) A PARTIR DE YEMAS
AXILARES
RESUMEN: La caoba ( Swietenia macrophylla King) es una especie forestal muy
cotizada por su madera, pero se encuentra amenazada por las deforestaciones
indiscriminadas y por el ataque severo de un insecto, conocido como el
barrenador de las meliaceas Hypsipyla grandella Zell (Lepidoptera,
Pyralidae) , ademas presenta una baja capacidad de regeneración. Para aumentar
la población de caoba, se planteó la propagación en masa
por cultivo in vitro. En este sentido, fueron cultivados segmentos
nodales en medio MS a la mitad de su fuerza iónica, complementado con
diferentes relaciones de acido naftalen acético (ANA) y 6-
benciladenina (BA) establecidas por el diseño estadístico
Compuesto Central Rotable (CCR), en un rango de 0-3 mg/L para ambas hormonas.
Las condiciones de cultivo fueron 25 ºC, -2 -1 16 h de luz
y 40-45 µmoles. m . s .
La superficie de respuesta resultante muestra un óptimo de alargamiento
de yemas laterales en unarelación 0 mg/L de
ANA y 1,94 mg/L de BA. No hubo diferencias significativas en los
vastagos de caoba cultivados en los diferentes medios de enraizamiento
estudiados. La metodología aplicada permitió obtener
plantulas de caoba aclimatadas. Palabras clave: Swietenia macrophylla
King, caoba, micropropagación, BA (Benciladenina), ANA (acido
Naftalenacetico), Compuesto Central Rotable, (CCR), segmentos nodales,
optimización de respuesta.
IN VITRO PROPAGATION OF MAHOGANY TREE (Swietenia macrophylla KING) FROM
AXILLARY BUDS
ABSTRACT: The mahogany tree (Swietenia macrophylla King) is a forest tree with
a great commercial value mainly due to its wood quality. Unfortunately, this
species is being threatened by the effect of intensive timber exploitation, its
low capacity to regenerate, and the attack of the Meliaceae shoot borer
(Hypsipylla grandella Zeller) (Lepidoptera Pyralidae). To increase population,
large-scale propagation of mahogany by in vitro culture was developed. To
obtain plantlets, nodal segments were cultured in a half-strength MS medium
supplemented with different combinations of naphthaleneacetic acid (NAA) and
6-benzyladenine (BA), specified by the Central Compositional Rotable
Statistical Design Method, within a range of 0-3 mg/L for both hormones.
Favourable incubation -2 -1 o conditions were: 16 h light, and 40-45
µmol. m . s at 25 C.
The derived response surface showed an optimal axillary bud elongation on a
mediumcontaining 1.94 mg BA/L and 0.38 mg NAA/L. No significant differences
were found neither applying Orellana Method nor modified Orellana method.
Mahogany plantlets obtained were successfully acclimated. Key Words: Swietenia
macrophylla King, mahogany, micropropagation, benzyladenine (BA),
naphthaleneacetic acid (NAA) rotable cental composite (RCC), nodal segments.
INTRODUCCION La caoba (Swietenia macrophylla King), especie
forestal, pertenece a la familia Meliaceae, de gran interés
económico, pero se encuentra en vías de extinción. En Venezuela
su habitat natural son los bosques de galería de los Llanos Occidentales.
Plonczak8, reporta la caoba como especie muy escasa, afirma que
esto se debe al mal manejo, deforestaciones continuas de los bosques tropicales
y la baja regeneración natural. Por otra parte, su establecimiento en
plantaciones se ha visto interferido por el ataque del barrenador de las
Meliaceae, la larva de la mariposa Hypsipyla grandella Zeller, que se alimenta
de la yema apical y la destruye2 causando deformación y
bifurcación del fuste lo cual disminuye la calidad y rentabilidad de la
madera.
Urge, por lo tanto, plantear estrategias para conservar la especie. Una
posibilidad es la propagación in vitro y la selección de
somaclones con características superiores. La FAO3 tiene una red que
coordina todos los estudios que se realizan en el area de
distribución natural de la caoba, la considera una de la especie
prioritaria paraestablecimiento de plantaciones comerciales de madera Sin
embargo, mientras no se garanticen individuos con características
superiores (ej. resistencia a plagas y enfermedades) y se recurra a un
método de propagación clonal masivo, sera imposible lograr
plantaciones verdaderamente rentables. La propagación in vitro de caoba
tiene pocos antecedentes, debido posiblemente a lo
recalcitrante de la especie. Lee y Rao4 obtuvieron vastagos adventicios
a partir de callos friables originados de segmentos nodales
8 de plantas de diferentes edades, cultivados en un medio modificado de
Murashige y Skoog6 complementado con benciladenina (BA) a concentraciones de
0,002 g/L y 0,005 g/L. Albarran1 encontró que los explantes de
mayor potencial para lograr vastagos eran también los segmentos
nodales de 0,5 cm, obtenidos de plantas germinadas in vitro y cultivados en un
medio MS modificado con diferentes relaciones de la auxina (acido indol
acético -AIA) y la citoquinina ( benciladenina BA). A través de
esta investigación se logró estandarizar una metodología
que ha permitido el desarrollo de yemas axilares, aislando segmentos nodales de
1 a 1 cm de longitud. Los mismos fueron sometidos a
diferentes tratamientos fitohormonales (ANA/BA), determinados por el
diseño estadístico Compuesto Central Rotable (CCR), el cual,
también aporta una metodología de analisis y optimiza
respuestas de variables dependientes (propagación de vastagos),
influenciadas porvariables independientes continuas (tratamientos)5. Finalmente los vastagos propagados en estos ensayos fueron
enraizados, obteniéndose así plantas de caoba aclimatadas.
MATERIALES Y METODOS
Tacoronte, Vielma, Mora y Valecillos 1–1,5 cm de largo, tomados entre el
tercer nudo y el nudo cercano a los cotiledones. Los mismos fueron cultivados
en tubos de ensayo de 50 ml Sigma®, llenados con 12 ml/tubo de medio MS
modificado, a la mitad de la fuerza ionica (MS/2) y complementado con los
diversos tratamientos (Tabla I), incluyendo el control, sin reguladores de
crecimiento. Se hicieron cuatro repeticiones de cada tratamiento, para
establecer un límite de confiabilidad de 95% en
las respuestas obtenidas. El total de las unidades experimentales fueron
ochenta, cuatro repeticiones por tratamiento y veinte explantes por cada
repetición. Los cultivos fueron incubados a 25ºC y 16h de luz con
intensidad de 40–45 µmoles/m2.s Enraizamiento Se ensayaron tres
métodos de enraizamiento: a) Orellana7 b) modificación del
método de Orellana7 y c) uso de un producto comercial, polvo enraizador
Hormonex. A continuación se describe cada metodología: a)
Orellana7 el método se realiza en tres etapas: 1) Inducción, 2)
expresión y 3) desarrollo de raíces. La inducción se
establece en un medio líquido con las sales MS/2, vitaminas de Morel al
40%, 0,0898 g/L de acido indolbutírico (AIB), 0,0229 g/L de
acido naftalén acético (ANA), 0,0049 g/L de kinetina,
sacarosa 15g/L y pH 5.6. Los vastagos fueron incubados
en oscuridad total, por 16 horas. Los explantes fueron subcultivados en
una solución en agua destilada conteniendo, AIB 0,0049 g/L y ANA 0,0049
g/L, pH 5,7 e igualmente en oscuridad total por 72 h. Para la expresión
de raíces, el medio de cultivo fue MS/2, suplementado con tiamina 0,0099
g/L, AIB 0,00059 g/L, ANA 0,0025 g/L, sacarosa 40 g/L, gelrite 2 g/L y pH de
5,7. Después de 10 días, los vastagos
fueron cultivados en el medio descrito por Pierrin y col9. con sacarosa 80 g/l, agar 9 g/L y pH 5,8; por 10 días
y un fotoperíodo de 16h luz. El desarrollo de raíces se
logró en un medio WPM/2, sacarosa 20 g/L carbón activado 5 g/L,
agar 8 g//L y pH a 5 . Los explantes fueron expuestos
durante 30 días en fotoperíodo de 16h de
luz. b) Consistió, este segundo método,
Orellana modificado (1997). Fueron inducidas las raíces sumergiendo la
base del
vastago en medio líquido MS/2, complementado con 0 g/L de AIB, 0,02346 g/L de ANA, 0,0057 g/L de
kinetina, sacarosa 20 g/L y pH 5,6. A las 48 horas los explantes fueron
subcultivados en una solución de agua destilada conteniendo AIB 0,005
g/L, ANA 0,005 g/L, a un pH 5,7. Los explantes fueron incubados por 72 h con un fotoperíodo de 16 h de luz, para ambos
tratamientos. La formación de raíces se hizo en medio MS/2,
suplementado con tiamina 0,0099 g/L, AIB 0,0005 g/L, ANA 0,0003 g/L, sacarosa
40 g/L, gelrite 2 g/L y pH 5,7. Después de 10 días, se
establecióel desarrollo de raíces cultivando los explantes en un
medio MS/2, sacarosa 20 g/L, carbón activado 5 g/L, agar 8g/L y el pH
5,7 por 20 a 30 días.
Material vegetal Los segmentos nodales de caoba con un
solo nudo, se extrajeron de plantulas de 4 semanas obtenidas por
germinación in vitro (Fig. 1). Las semillas germinadas
fueron obtenidas de frutos recolectados en la Ciudad de Caracas- Distrito Federal.
Los arboles de caoba (Swietenia macrophylla King) seleccionados
presentaban fuste recto, altura promedio de 5-6 m vigorosos y abundantes frutos
grandes, con apariencia de no haber sido atacados por
plagas. La recolección de frutos se realizó entre los meses
noviembre y diciembre. Medios de cultivo El medio Murashige y Skoog6 a la mitad
de su fuerza iónica (MS/2) fue utilizado tanto para la
germinación como para el cultivo de los explantes, modificando la
concentración de NH4NO3 de 1 g/L a 2 g/L, sacarosa
de 30 g/L a 20 g/L y el agar a 7 g/l, pH 5,7 – 5,8. Particularmente para
el cultivo de los explantes, el medio fue complementado con ANA y BA, en
concentraciones de 0 a 0,003 g/L, según lo determinado por el
diseño CCR (Tabla I). Micropropagación A partir de
plantulas de caoba germinadas in vitro fueron aislados segmentos
uninodales (Fig. 2), con
Propagación in vitro de caoba c) Tratamiento con Hormonex: la base de
los explantes fue sumergida en agua destilada estéril, para adherir el
polvo enraizador Benomil, el cual contiene AIB(1,0%) e
ingredientes inertes (98,9%). Se aplicó una prueba Z,
para comparar proporciones entre los tratamientos. Para
p ≤ 0.05 y n = 60 explantes para cada tratamiento.
9 0–2 mg/L de BA. Analizando en conjunto los
resultados; los mejores tratamientos fueron el 2, 7 y 10, donde se pudo
observar que la emergencia de yemas fue del 100 % para los tratamientos 7 y 10,
y 95 % para el tratamiento 2. Sin embargo, no todas estas
yemas produjeron vastagos. En el tratamiento 7 se alcanzó
aproximadamente una producción de vastagos de un
96%. El tratamiento 2 en 73 % y tratamiento 10 en un
72,72%. Tomando en cuenta el desarrollo de estos vastagos es en el
tratamiento 2 donde se obtuvo la mayor estimulación del crecimiento longitudinal hasta alcanzar
vastagos de 2 cm promedio, de
coloración palidos y con hojas enrolladas en su mayoría.
Por otro lado, en el tratamiento 10 se presentaron vastagos de una
longitud de 1 cm (promedio) pero vigorosos,
folíolos bien desarrollados, extendidos y de color verde intenso. (Fig 6a y 6b). Entre los tratamientos 10 y
7, hubo diferencia significativa en las respuestas (Fig 7a y 7b). El
tratamiento 7 produjo un número de vastagos vigorosos que
presentaron una menor longitud promedio (0 cm).
RESULTADOS Y DISCUSION
Efecto de las relaciones ANA/BA en las yemas laterales Los tratamientos
aplicados a segmentos uninodales (Tabla I), presentaron tres tipos de
respuestas: estimulante, intermedia e inhibitoria,reflejadas
en la emergencia o no de la yema (Fig.3). Dichas yemas tuvieron posteriormente
dos tipos de respuestas: alargamiento hasta obtener vastagos (Fig.4) o
el poco desarrollo, obteniéndose estructuras de morfología
arrosetadas (Fig.5).
Figuras 1 – 4. 1- Plantas vigorosas de caoba (Switenia macrophylla King,
obtenidas por germinación de semillas aséptica. 2- Segmentos
nodales de un nudo obtenidas a partir de vitro-plantulas. 3- Explante de
segmento nodal, con respuesta de brote de la yema axilar. 4- Desarrollo del vastago
a partir de yema axilar, en segmento nodal de un nudo.
Figuras 5 – 7. 5- Yema arrosetada, el crecimiento del vastago
no es alargado y un conjunto de hojas poco desarrolladas que se concentran en
el apice. 6a- Vastago con características
morfológicas típicas del
tratamiento 2, de una longitud promedio de 2 cm
palido, hojas enrolladas. 6b- Vastago de características
morfológicas típicas del
tratamiento control de aproximadamente una longitud de 1
cm. vigoroso y con hojas extendidas de verdor intenso. 7a-
Vastagos del tratamiento 7. Se caracterizan por una longitud
promedio de 0,7cm, vigor y presencia de hojas extendidas con verde intenso. 7b-
Vastagos resultantes del tratamiento control, con
mejores características que favorecen al enraizamiento.
Respuesta estimulante El mayor número de vastagos se obtuvo
dentro de un rango de concentración 0 – 0
mg/L para ANA y entre La mejor inducción y formación debrotes se
obtuvo en aquellos medios sin auxina o con bajas concentraciones de las mismas.
10 Respuesta intermedia A iguales concentraciones de
las fitohormonas utilizadas, el porcentaje de respuesta fue menor, en
comparación con los resultados antes descritos. Así, en el
tratamiento 1 se alcanzó un 69 % en
formación de vastagos, seguido por un 66,66 % para el tratamiento
5 y luego un 33,33 % para el tratamiento 4. Las características
morfológicas de cuyos vastagos son de poco vigor y de poco
desarrollo foliar, tomando muchos de ellos, la apariencia de yemas arrosetadas
(Fig. 5) condición que limita el estímulo para un
desarrollo radical. Respuesta inhibitoria Cuando la concentración de la
auxina es mayor que la citoquinina, hay tendencia a
obtener pocos vastagos, de éstos presentaban poco vigor
tratamientos 3, 6 y 9. El tratamiento 6 alcanza los valores mas bajos
8,57%; aumenta el tratamiento 9 con 25% y el 27,27% para el tratamiento 3.
Finalmente la relación auxina/citoquinina conveniente es la que responda
en igual cantidad de vastagos del
tratamiento 7, igual calidad del tratamiento
10 y respuestas tempranas como
el tratamiento 2. Vastagos vigorosos, hojas de color verde intenso, y
longitudes mayores de 1cm. son las características apropiadas para
garantizar el enraizamiento y obtener plantas completas con una mayor
posibilidad de aclimatación y capacidad de sobrevivencia. Indudablemente
que las distintas respuestas estan sujetasa las concentraciones de
auxina /citoquinina implementada y son los vastagos resultantes del
tratamiento 10 los que garantizan plantas completas y con mayor facilidad al
proceso de adaptación al ambiente. La Tabla I resume las distintas
respuestas de los explantes de segmentos uninodales a diferentes
concentraciones de ANA/BA (auxina/citoquinina) conformando en total diez
tratamientos, presentandose tres tipos de respuestas: brote, yemas
arrosetadas, vastagos o lo que es lo mismo alargamiento de yema, todo
expresado en porcentaje. Analisis estadístico Las respuestas de
brote y vastago de cada explante fueron ajustadas a un
modelo polinómico. Se determinó la varianza y
el coeficiente de determinación (R2), el cual indica en que medida la
relación auxina/citoquinina interviene en las respuestas. Las
ecuaciones polinómicas (Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X12 + B4X22 + B5X1X2 +
E) fueron graficadas (Figs. 8 y 9) para obtener una superficie de respuesta,
mostrandose el efecto poco estimulante de ANA para la obtención
de vastagos, mientras que el aumento de concentración BA, da
resultados favorables.
Tacoronte, Vielma, Mora y Valecillos
Figura 8. Superficie de respuesta de brotes para segmentos nodales de un nudo.
Figura 9. Superficie de respuesta de vastagos
para segmentos nodales de un nudo.
Lo anterior queda confirmado con los resultados del tratamiento 7 (Tabla I), donde no
actúa ANA y BA es de 1 mg/L, se logra la
mayor cantidad devastagos. Pero, se hace hincapié
que el analisis estadístico sólo incluye la cantidad y no
la calidad de la respuesta, aspecto de mucha importancia en esta
investigación. En este sentido, se
recomienda experimentar con bajas concentraciones de ANA, en busca de aumentar
la cantidad de vastagos vigorosos y de longitudes apropiadas, evitando
una supuesta descompensación hormonal endógena reflejada en
aspectos morfológicos. El rango óptimo de auxina/citoquinina,
señalado por el diseño estadístico, esta
comprendido entre 0 y 1,94 mg/L. Para respuestas de brote, R2 = 0,513 indica
que la relación auxina/citoquinina interviene en un 51,3 % en el brote
de yema axilar.
Propagación in vitro de caoba Para
vastago R2=0,821 indica que la relación auxina/citoquinina
esta involucrada en un 82 % en el alargamiento
de la yema axilar. Enraizamiento de vastagos
propagados Los resultados de los tres tratamientos de enraizamiento se muestran
en la Tabla II. El primer tratamiento es el de mayor estimulo de
rizogénesis (57%); sin embargo, el porcentaje obtenido varía muy
poco con el segundo tratamiento (55%), ademas estadísticamente se
evidencia que los datos estudiados no proporcionan diferencias significativas
de enraizamiento, para un p ≤ 0.05. En lo referente al tratamiento 3 por no inducir raíces en
ninguno de los explantes, fue descartado sin ninguna objeción.
11 Para la propagación de caoba in vitro, los resultados de esta
investigación permitenconcluir que para el desarrollo y alargamiento de
las yemas axilares, es necesaria una relación óptima de ANA/BA en
el rango de 0 a 1,94 mg/l de cada hormona. Las
concentraciones bajas de ANA, favorecen la obtención de vastagos.
El enraizamiento de estos vastagos es posible aplicando el método
de Orellana modificado o no; sin embargo se recomienda el modificado, por ser
mas rapido. Estas condiciones permitiran
obtener plantas de caoba completas y vigorosas. AGRADECIMIENTOS Al
CDCHT-ULA por el financiamiento de este trabajo a
través del
Proyecto CVI-PIC-02-98. Al Sr. Sócrates Pérez por su
colaboración en el trabajo fotografico
Tabla I: Porcentaje de brotes, yemas arrosetadas y vastagos obtenidos a
partir de segmentos nodales de un solo nudo de S.
macrophylla cultivados en tratamientos con diferentes concentraciones de
ANA/BA.
Nº de tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Relación ANA/BA mg/L 0,44/0,44 0,44/2,56 2,56/0,44 2,56/2,56 1,5/1,5
3/1,5 0/1,5 1,5/3 1,5/0 0/0
Brotes % 97,95 95,5 72,7 92,3 88,88 34,28 100 78,78 75 100
Yemas Arrost. % 24,48 16,30 27,27 28,20 10,00 14,29 0,00 27,27 25,00 6,06
Vastago % 69,38 73,30 27,27 33,33 66,66 8,57 95,83 30,30 25,00 72,72
Tabla II: Porcentaje de enraizamiento de vastagos en diferentes
tratamientos. *
Tratamientos A B C
Enraizamiento (%) 57 55 0
* Población = n = 60 vastagos por tratamiento
12 REFERENCIAS
Tacoronte, Vielma, Mora y Valecillos
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