EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LOS MICROOGANISMOS

INTRODUCCION

Los microorganismos como grupo demuestran una capacidad extraordinaria para vivir y reproducirse a lo largo de un amplio rango de temperaturas (desde temperaturas bajo 0°C, hasta temperaturas que alcanzan los 113°C). Los microorganismos se han agrupado en cuatro categorías, a base de su rango de temperatura óptimo para el crecimiento. Las categorías son: psicrofílicos, mesofílicos, termofílicos e hipertermofílicos. El rango de temperatura óptimo y el límite mínimo y maximo de temperatura que distinguen a cada grupo no se deben tomar como valores absolutos que establecen la frontera entre una y otra categoría y sí como un reflejo del habitat natural donde se desarrolla cada grupo. De hecho, el rango de temperatura que define a cada categoría varía de un grupo de microorganismos a otro. Al presente, el límite maximo de temperatura que define a los diferentes grupos de microorganismos termofílicos es el siguiente

• Protozoarios termofílicos .. 56°C
• Algas termofílicas . 55 - 60°C
• Hongos termofílicos . 60 - 62°C
• Cianobacterias termofílicas .. 70 - 74°C
• Bacterias fototróficas termofílicas 60 - 62°C
• Eubacterias organotróficas termofílicas .. 90°C
• Arquebacterias (hipertermofílicas 113°C
(Madigan et al., 1994)

El efecto de latemperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción (Sinclair & Kristiansen, 1987).

OBJETIVOS
• Conocer y describir el efecto de la temperatura en el crecimiento de los microorganismos.
• Conocer y describir las clases de microorganismos según la temperatura.
• Mencionar y describir el efecto letal del calor en los microorganismos.
• Mencionar y describir el efecto de las bajas temperaturas sobre las bacterias.

CONTENIDO
I. EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LOS MICROORGANISMOS
1.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
La temperatura es uno de los parametros ambientales mas importantes que condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos.
La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de generación). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se mantienten constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos llamados temperaturas cardinales
• Temperatura mínima: por debajo de ella no hay crecimiento;
• Temperatura maxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento;
• Temperatura óptima: permite la maxima tasa de crecimiento.

Fig. 1 Acción de la temperatura frente a la tasa de crecimiento de microorganismos con sus diferentes etapas.

El margen entre la temperatura mínima y la maxima sesuele llamar margen de crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.
La temperatura mínima se puede explicar en función de un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos de transporte de nutrientes y el gradiente de protones.
Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, debido a que las reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su óptimo. En dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su maxima tasa posible.
A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura maxima. Dicha temperatura refleja desnaturalización e inactivación de proteínas enzimaticas esenciales, colapsamiento de la membrana citoplasmica y a veces lisis térmica de la bacteria.
1.2 CLASES DE MICROORGANISMOS SEGÚN LA TEMPERATURA:
ADAPTACIONES EVOLUTIVAS
Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperatura maxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera. Según el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales
1.2.1 MICROORGANISMOS PSICRÓFILOS
Las psicrófilas o criófilas: crecen a partir de entre -5 a 5ºC.
a) Las llamadas psicrófilas obligadas tienen temperatura óptima a 15-18ºC, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteriaPolaromonas vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antartida es lo que pudiéramos llamar un psicrófilo extremo: tiene su óptimo de crecimiento en 4ºC, y es incapaz de crecer a 14ºC (¡se muere de calor!).
b) Las psicrófilas facultativas o psicrotolerantes (también llamadas psicrotrofas) presentan temperatura óptima en torno a los 20-30ºC y maximas a los 35ºC. Las bacterias y hongos psicrotrofos son los responsables de que los alimentos guardados en nevera se estropeen al cabo del tiempo.
Ejemplos de medios permanentemente fríos son la mayor parte de las aguas oceanicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las profundidades alcanzan sólo 1-2ºC por encima de cero) y las areas permanentemente heladas del Artico y de la Antartida. En los medios helados existen pequeñas bolsas o microcavidades de agua líquida, donde pueden medrar algunos microorganismos.

Las principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos exhibidas por estos microorganismos psicrófilos son
• enzimas mas resistentes al frío;
• sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas;
• los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de acidos grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados, con entre 4 y 9 dobles enlaces); ello supone que la membrana sigue en su estado semifluido, evitandose su congelación.
Los psicrotrofos (psicrófilos facultativos) son mas abundantes, ya que estan adaptados a soportar grandes oscilaciones térmicas, y en verano pueden crecer a unos 30ºC-40ºC. Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche,frutas y hortalizas) que se guardan en frigoríficos, alterando las cualidades organolépticas e incluso, echandolos a perder (una experiencia que casi todos hemos tenido).
1.2.2 MICROORGANISMOS MESÓFILOS
Los mesófilos presentan temperaturas óptimas a los 25-40ºC y maximas entre 35 y 47ºC. La mayor parte de las eubacterias (incluyendo las patógenas) pertenecen a esta categoría. La mayor parte de los microorganismos que viven en ambientes templados y tropicales, incluyendo los simbiontes y parasitos, pertenecen a esta categoría.
1.2.3 MICROORGANISMOS TERMÓFILOS
Las únicas formas de vida capaces de vivir por encima de 65ºC son todas procariotas. Los termófilos presentan óptimos a 50-75ºC y maximos entre 80 y 113ºC. Dentro de esta categoría se suele distinguir las termófilas extremas (=hipertermófilas), que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100ºC, y que taxonómicamente pertenecen al dominio de las Archaea.
Los habitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima de 45-50ºC) estan restringidos a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente relacionadas con fenómenos volcanicos
• fuentes termales volcanicas terrestres (en zonas de EE. UU., Japón, Nueva Zelanda e Islandia);
• fuentes termales submarinas: los llamados “humeros” (fumarolas hidrotermales) asociados a las grandes dorsales oceanicas);
• Fumarolas
• Los materiales en fermentación como acúmulos de abono (compost) y ensilados pueden alcanzar 65ºC.


Las principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas en células vegetativas bacterianas son
• enzimastermorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy hidrófobo
• ribosomas termorresistentes;
• membranas ricas en acidos grasos saturados, que permiten enlaces hidrofóbicos mas fuertes.
• En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse en ésteres de acidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace éter es mas resistente). Algunas, ademas, en vez de la típica bicapa lípídica, exhiben una monocapa bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse “cola con cola” dos C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes ambientales.
1.3 EFECTO LETAL DEL CALOR
Al subir la temperatura por encima de la temperatura maxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idóneo. La muerte por calor es una función exponencial de primer orden
dN/dt = -KT•N
O sea, y como se puede constatar en la figura 2, la acción del calor supone la muerte de una fracción constante (KT) de la población sobreviviente en cada momento.
La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la membrana).

Fig. 2 Acción del calor frente al tiempo y supervivencia en microorganismos.
Ejemplos
punto térmico mortal Especies55oC Escherichia coli
60oC Mycobacterium tuberculosis
120oC endosporas de especies muy resistentes de Bacillus.
En general, esterilización todo tratamiento de un material con un agente físico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o químico que acarrea la eliminación de toda forma de vida en él. Una vez estéril, el material sigue estéril indefinidamente con tal de que esté encerrado en un compartimento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior. La inactivación parcial o la esterilización se pueden lograr por calor húmedo o por calor seco.
La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización de proteínas y a la fusión de lípidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces débiles, sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlaces se rompen mas facilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.
1.3.1 CALOR HÚMEDO
La inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua.
Microorganismo condiciones
La mayoría de células vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos 80oC , 5-10 min
Bacilo tuberculoso 58oC , 30 min
Bacilo tuberculoso 59oC , 20 min
Bacilo tuberculoso 65oC , 2 min
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC , 60 min
La mayoría de esporas de bacterias patógenas 100oC , pocos min
esporas del patógeno Clostridium botulinum 100oC , 5,5 horas
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC , muchashoras
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC , 15 minutos
Métodos principales de lograr esterilización de materiales por calor húmedo:
Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sin que ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. (El funcionamiento del autoclave sera oportunamente explicado en clases practicas). Los parametros de esterilización suelen ser: temperatura 121ºC y 10-15 min.
La acción rapida del calor húmedo depende en buena parte del alto valor de calor latente del agua (540 cal•g-1); ello hace que los objetos mas fríos (como las muestras a esterilizar) se calienten rapidamente por condensación de agua en su superficie.
Tindalización (nombre en honor de John Tyndall): Es un método de esterilización fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a mas de 100ºC. Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 ó 4) de dos fases sucesivas cada uno:
a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100ºC, durante 1 ó 2 horas;
b) en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37ºC durante 24 horas.
Durante las fases de tipo a) mueren todas las células vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se produce la germinación de las esporas activadas en la respectiva faseanterior. En la siguiente fase de tipo a) moriran las células vegetativas procedentes de la germinación en la fase anterior; y así sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningun microrganismo en la muestra.
Este método es bastante engorroso y consumidor de tiempo, por lo que en los últimos años ha sido reemplazado por otro método de esterilización, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilización por filtración. Consiste de hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana (diametro de poro =0 mm).
Aplicaciones principales del calor húmedo
1. En la practica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de medios de cultivo y soluciones.
2. En la esterilización de material quirúrgico.
3. En la esterilización o inactivación parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados).
a) En la industria lactea se emplean como métodos de esterilización la llamada uperización. La uperización o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de calor húmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. ej.: 135-150ºC durante 1-2 seg).
b) Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los posibles microorganismos patógenos que pueden contaminarla, y que son mas sensibles al calor que los saprófitos inofensivos. Con esta inactivación parcial de la población microbiana de la leche logramos queésta se conserve durante unos días, sin alterar apenas sus cualidades organolépticas y nutricionales. He aquí los procedimientos mas habituales para conseguir esto
i. La pasteurización (en honor a Pasteur, que la introdujo en los años 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfría y envasa rapidamente.
ii. La pasteurización instantanea (también conocida por sus siglas en inglés HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72ºC durante sólo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfría rapidamente. Esta técnica es la mas usada actualmente, ya que
• mata mas rapidamente;
• mata mejor organismos mas resistentes;
• altera menos el sabor;
• actúa en flujos continuos (y permite procesar grandes volúmenes de leche).
Tras la pasteurización, el número de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patógenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc) son eliminados facilmente. La pasteurización también se emplea para la preparación de vacunas a base de microorganismos inactivados por el calor.
1.3.2 CALOR SECO
La esterilización por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la fusión de membranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor seco son los daños por oxidación y el provocar un aumento de la concentración de electrolitos.
Aplicaciones del calor seco
1. El llamado hornode Pasteur, mediante calentamiento a 160-170ºC durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metalico, aceites y jaleas, etc.
2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metalicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias.
3. Incineración de materiales de desecho.
1.4 EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS
Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) no son útiles para la esterilización, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación (p. ej., especies patógenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas es, sobre todo, bacteriostatico, sin contar aquellos organismos psicrófilos o psicrotrofos.
Los efectos de someter una suspensión bacteriana a temperaturas menores de 0ºC dependen de
• el medio donde estan suspendidas las bacterias;
• el modo en que se realice la congelación y una ulterior descongelación.
Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelación del medio, el citoplasma queda en sobrefusión (sin congelar) entre -1 y -10ºC. Pero como la tensión de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser:
• por pérdida de agua de la célula (cuando la congelación se efectúa lentamente), o bien
• por cristalización de agua en el interior (cuando la congelación se realiza rapidamente).
En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo que supone que la solución del citoplasma puedellegar a saturarse, con precipitación de sales. Ello conlleva varias consecuencias: los cristales de sales y la alta concentración de electrolitos provocan la desnaturalización de proteínas y daños a la membrana; otro efecto de menor importancia es el daño mecanico a la pared celular y a la membrana provocado por los cristales de hielo.
En general, el enfriamiento rapido es mas lesivo que el lento, existiendo una velocidad óptima. Cuando una bacteria se enfría rapidamente a -35ºC se producen cristales de hielo que provocan daños cuando la muestra se descongela.
Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la descongelación, y el número de ciclos de congelación-descongelación. La descongelación lenta es mas letal que la rapida, ya que aumenta el volumen de cristales de hielo.
Aplicaciones de la congelación
La congelación se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cómo se efectúa tanto la congelación como la descongelación. Una vez congeladas, las bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutéctico
• en nieve carbónica (CO2 sólido), a -78ºC;
• en nitrógeno líquido, a -180ºC.
Por ello, este método es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbónica o nitrógeno líquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Comoveremos enseguida, hay métodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras microbianas durante largos periodos de tiempo.
Para preservar aún mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a añadir a la suspensión ciertas sustancias, como por ejemplo:
• Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la solidificación amorfa y vítrea, en lugar de la cristalización, evitando así la formación de zonas intracelulares con alta concentración de sales: glicerina, sacarosa, lactosa, dimetilsulfóxido (DMSO).
• Materiales ricos en proteína: leche, suero, extracto de carne.
• Proteínas purificadas (p. ej., la albúmina).
• Determinadas macromoléculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.
La suspensión bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas sustancia entre -25 a -30ºC, en congelador. Si se hace con nitrógeno líquido, la conservación puede ser de varios años.
CONCLUSION
Se conoció y describió el efecto de la temperatura en el crecimiento de los microorganismos, mencionando las clases de microorganismos según la temperatura, el efecto letal del calor y de las bajas temperaturas sobre los mismos.

BIBLIOGRAFIA

Iañez, E. 2005. Microbiología general. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. España. Disponible en URL: https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisicos.htm
Madigan, M.; J .Martinko & J. Parker. 1994. Brock: Biología de los microorganismos. Edit. Pearson. 1011 pag.

Sinclair, C.& B. Kristiansen. 1987. Fermentation kinetics and modeling. Ed.: J.D. Bu'Lock. Open University Press.