Electroforesis
Técnica que describe la separación en un campo
eléctrico de bio-moléculas al migrar a través de un medio de soporte (geles de
agarosa o poliacrilamida para ácidos nucleicos), lo cual depende de su carga
eléctrica, forma y tamaño.
Geles de poliacrilamida (PA
Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, que
permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado; variando
la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamaño del
poro, aunque cada vez se emplea menos en diagnóstico por su neurotoxocidad.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido
de algas, como
el agar-agar, pero de composición homogénea), cuyas disoluciones (~0.5 a 2 %)
poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50s C y formar un gel
semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama
tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio
líquido, que retarda el paso de las moléculas.
Fuentes de error en la electroforesis
Es una técnica muy sensible que puede ser afectada por muchos errores
experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del
gel, la velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del
reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.
TINCION DEL ADN DESPUES DE LA ELECTROFORESIS
Bromuro de etidio
Lafluorescencia en esta tinción es inducida por la luz
ultravioleta que pasa a través del
bromuro de etidio, ya que es una molécula planar que se intercala entre las
bases apiladas de DNA, su posición estable y su proximidad a las bases favorece
un incremento en la fluorescencia. Puede utilizarse para
detectar cadenas dobles y sencillas de DNA y RNA.
Nitrato de plata
Solo se aplica a geles de poliacrilamida (PA), y se divide en los siguientes
pasos: fijación, tinción con plata, enjuague del exceso de
plata, revelado y secado. La solución fijadora ayuda a que el DNA se fije al
gel de PA. Al aplicar la plata, la carga positiva de sus iones de plata le
permiten unirse al DNA, y su reducción posterior con la solución reveladora
cambia su color formando de bandas en el gel. Su principal
ventaja es su sensibilidad, hasta 100 veces mayor que el bromuro de etidio.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas,
son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester.
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como
un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en
la célula.
Nomenclatura
a– se nombran a partir de las bacterias de las
que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria
de donde se aisló por primera vez esta enzima.
a– La primera letra representa el género de la
bacteria, las próximas dos indican laespecie, una cuarta letra indica la cepa,
y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.
Ej:
Eco RI ( E = género Escherichia
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Existen 3 tipos:
Tipo I y Tipo III
a– Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan) por
una enzima metiltransferasa que transfiere grupos metilo desde
S-adenosilmetionina a bases específicas (A, G C o T)
a– Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, ya sea
río arriba o río abajo. Las Tipo I cortan lejos de la secuencia de
reconocimiento, y las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la
secuencia que reconocen
a– Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el
lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
Tipo II
a– Sólo tienen actividad de restricción
a– Cortan de manera consistente y predecible dentro de una secuencia
palindrómica (se lee igual al derecho y al revés) que reconocen.
a– Sólo requieren Mg++ como cofactor.
a– No necesitan ATP.
a– Las enzimas tipo II, dependiendo de su
especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes: Cortes pegajosos,
dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) porque tienden a
aparearse o hibridarse nuevamente con otro extremo cortado con la misma enzima
(Figura de arriba). CortesROMOS, cortan la misma posición en ambas cadenas del
ADN
TRANSFERENCIA DE SOUTHERN, NORTHERN Y WESTERN
SOUTHERN BLOT
Definición.
Hibridación de una cadena sencilla de ácido nucleico (DNA o RNA) con fragmentos
de DNA inmovilizados en un filtro. Fue la primera
técnica de este tipo; el apellido de su descubridor es
Southern, y las otras técnicas siguieron ese modelo de denominación. Edward
Southern desarrollo la utilización de segmentos de DNA clonado, separados por
electroforesis, transferidos a filtros, y rastreados con sondas.
Procedimiento.
1. Preparación de la muestra de DNA.
2. El DNA se corta (digestión enzimática) por acción de las enzimas de
restricción.
3. Por electroforesis el DNA se desnaturaliza.
4. Se hace la transferencia del DNA que esta en gel, a la
membrana de nitrocelulosa o nylon.
5. Se somete a hibridación de las sondas (fragmentos complementarios al DNA de
interés) con el DNA que esta en la membrana, en ciertas condiciones
fisicoquímicas y de temperatura.
6. Se aplica la Autorradiografía, cubriendo el filtro con una película de rayos
x después se revela y se observa la secuencia complementaria.
Usos
Identificación de fragmentos de DNA que contiene determinado gen para
diagnósticar enfermedades genéticas humanas
Identificación de genes relacionados en diferentes especies
Para detectar reorganizaciones y duplicaciones
en genes asociados a cánceres.
[pic]
NORTHERN BLOT
Definición.Hibridación de una cadena sencilla de ácido nucleico (DNA o RNA) con
un fragmento de RNA inmovilizado en un filtro. Esta
técnica se utiliza para determinar si un gen clonado
es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un tejido dado.
Procedimiento
1. El RNA es extraído y colocado en un gel de azarosa (NO HAY DIGESTION)
2. Por electroforesis se observa la separación de este.
3. Se hace la transferencia del RNA en gel a la membrana de
nitrocelulosa o nailon.
4. Se somete a hibridación de sondas con el RNA que esta en la membrana, en
ciertas condiciones fisicoquímicas y de temperatura.
5. Autorradiografía: Se cubre el filtro con una película de rayos x después se
revela y se observa la secuencia complementaria.
Usos: Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en células o
tejidos.
Para detectar cortes empalmes altenartivos del mRNA, y/o múltiples
tipos de transcritos provenientes de un solo gen.
WESTERN BLOT
Definición.
Detección de proteínas inmovilizadas sobre un filtro
mediante la reacción complementaria con un anticuerpo específico. Las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis
en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren a una membrana.
En este método se emplea un anticuerpo primario para
localizar la proteína de interés. Un segundo
anticuerpo marcado (fluorescencia, radioactividad, colorimetría, etc.) contra
la especie en la que se ha producido el primero, se empleapara localizar donde
se formaron los complejos antígeno-anticuerpo.
Procedimiento
1. La muestra es colocada en el gel de poliacrilamida generalmente donde se
encuentran en este caso las proteínas del
virus de VIH.
2. Electroforesis de poliacrilamida donde las proteínas migran según su carga,
masa y forma por el gel.
3. Se transfiere el gel a la membrana de nylon que absorbe las proteínas ya
separadas
4. Inmersión de la membrana de nitrocelulosa en una solución con anticuerpos
donde los anticuerpos se vinculan de manera específica a las proteínas virales antigénicas(proteínas del VIH)
5. Así la 2S serie de anticuerpos se fija en la primera y se pone de relieve la enzima que tiene un receptor específico.
6. Las proteínas virales son separadas y coloreadas por anticuerpos marcados
7. Si la coloración aparece (la muestra amarilla y las corridas de la demás
muestra verde) la prueba es seropositiva para el VIH
Usos
En 'Western blot' se emplea comúnmente el sistema de inmunodetección indirecta.
La técnica del Western blot tiene muchas aplicaciones
en los laboratorios de investigación pero también ya ha sido transferida al
diagnóstico de las enfermedades virales.
Para el caso de las infecciones con el virus HIV es una de las técnicas usuales
para detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra las proteínas del
virus que es una indicación muy fuerte de que la persona se encuentra infectada
por este virus.
