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Extraccion, purificacion e identificación de dna - Cuantificación de ADN



Introducción
En 1869, Johann Friedrich Miescher, a partir de los núcleos de los linfocitos del pus (sustancia de importancia médica) creó un método para aislar dichos núcleos que le permitió establecer que dicho material contenía una sustancia levemente acida con alto contenido de fósforo (ADN + Proteínas) que llamó Nucleina, nombre que mas tarde fue corregido como Acido Nucleico por uno de sus estudiantes.
Posteriormente, los investigadores concluyeron que la base física de la herencia se hallaba en el núcleo, se determinó que el ADN contiene cuatro bases nitrogenadas: Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) y Citosina (C); y que estas a su vez forman parte de los nucleótidos que son las unidades, en gran cantidad, que constituyen al ADN.
Los experimentos relacionados con la naturaleza del material genético sentaron las bases en uno de los principales progresos en la historia de la biología: el descubrimiento de la estructura tridimensional del ADN realizado por James Watson y Francis Crick en 1953. Proponiendo un modelo constituido por dos cadenas de nucleótidos que se enrollan helicoidalmente. (Pierce, 2005)



Objetivo

El alumno obtendra, purificara e identificara el DNA de las hojas de higo en el laboratorio mediante una técnica sencilla y facil en su aplicación.


Fundamento

La obtención deADN se realiza con una metodología basa en las propiedades fisicoquímicas de éste. De tal manera que no se modifique su estructura y pueda identificarse mediante la reacción de uno de sus componentes: la Desoxi-D-ribosa con difenilamina.

Resultados

Luego de haber sometido la muestra a varios ciclos de centrifugación obtuvimos una “masa” de aspecto blanquesino, en el tubo de la solución
Cuando se hizo reaccinar el DNA con difenilamina el color de la sustancia se tornó azul, pues, la cadena lineal se convierte en β-hidroxilevulinoaldehido altamente reactiva y reacciona con la difenilamina En el ADN solo reacciona la desoxiribosa de nucleótidos puricos, así que el valor obtenido representa la mitad del total de desoxiribosa presente.
Para la electroforesis de DNA frecuentemente se utiliza poliacrilamina como matriz de los geles en el analisis de DNA cortos, mientras que para la separación de DNA mas largos normalmente se emplea agarosa (Nelson, Cox, 2009), como hizo en esta practica.
El resultado es una disolución que contiene una mezcla de fragmentos marcados acabados en un residuo C. cada residuo C en la secuencia genera un conjunto de fragmentos de una longitud determinada, de forma que el tamaño de los fragmentos, separados por electroforesis, indica la localización de los residuos C en lasecuencia. (Nelson, Cox, 2009) Este procedimiento se repitió separadamente para cada uno de los 10 ddNTP, y la secuencia puedo leerse directamente de la autoradiografía del gel.



Reconocimiento de prótidos |
MATERIALES * Tubos de ensayo * Gradilla * Mechero * Vasos de precipitados * Pipetas | * Solución de HCl concentrado * Alcohol etílico * Solución de SO4Cu al 1% * NaOH al 20% * Clara de huevo o leche * Solución de albúmina al1-2% |
1. COAGULACIÓN DE LAS PROTEÍNAS     FUNDAMENTO
Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales que pueden precipitar formandose coagulos al ser calentadas a temperaturas superiores a 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, acidos, alcohol, etc.
La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados que al actuar sobre la proteína la desordenan por destrucción de sus estructuras secundaria y terciaria.     TÉCNICA 1. Colocar en tres tubos de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo (puede diluirse en un poco de agua para obtener una mezcla espesa) o 2-3ml de leche. 2. Calentar uno de los tubos al baño María, añadir a otro 2-3ml de HCl concentrado y al tercero 2 o 3ml de alcohol etílico. 3. Observar los resultados.2. REACCIONES COLOREADAS ESPECÍFICAS (BIURET)     FUNDAMENTO
Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto parasu identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoacidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoacidos.
El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre(II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas.     TÉCNICA 1. Colocar en un tubo de ensayo 3ml de solución de albúmina al 1-2%. 2. Añadir 4-5 gotas de solución de SO4Cu al 1%. 3. Añadir 3ml de solución de NaOH al 20%. 4. Agitar para que se mezcle bien. 5. Observar los resultados.
CUESTIONES 1. ¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo? 2. ¿Cual de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización? 3. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína? 4. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret? 5. ¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret? 6. Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoacido como la Glicina ¿es positiva o negativa? ¿Por qué? Reconocimiento de glúcidos |
MATERIALES * Tubos de ensayo * Gradilla * Pinzas * Mechero * Pipetas * Solución de Lugol | * Solución de Fehling A y B * Solución alcalina (sosa, potasa, bicarbonato, etc.) * ClH diluido * Soluciones al 5% de glucosa,maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa y almidón. |
1. ESTUDIO DE AZÚCARES REDUCTORES     FUNDAMENTO
Los monosacaridos y la mayoría de los disacaridos poseen poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este caracter reductor puede ponerse de manifiesto por medio de una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la citada reacción y que, por lo tanto, el glúcido presente es reductor.     TÉCNICA 1. Poner en los tubos de ensayo 3ml de la solución de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o sacarosa (según indique el profesor). 2. Añadir 1ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1ml de Fehling B (lleva NaOH para alcalinizar el medio y permitir la reacción) 3. Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan. 4. La reacción sera positiva si la muestra se vuelve de color rojo y sera negativa si queda azul o cambia a un tono azul-verdoso. 5. Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de practicas con las dis Los fragmentos mas cortos migran a mayor velocidad de manera que los mas cercano al extremo inferior del gel representan las posiciones mas cercanas al extremo 5’ y la secuencia se lee de abajo hacia arriba (5’ 3’).

Cuantificación de ADN |
Control Equipo 5 |
dsDNA 2.00 µg/µL | dsDNA 0.6 µg/µL |
260/280= 2.04 | 260/280= 1.71 |
Alto en RNA | Puro |

Conclusión

A pesar de que todos los equipos llevamos a cabo el mismo procedimiento y utilizamos la misma cantidad de materia organica, esta se empleo de distintos vegetales, por tanto nuestros resultados fueron distintos.
Al parecer, nuestra electroforesis mostro un mal procedimiento pues no se pueden observar fragmentos en la radiografía; sin embargo, la tabla de cuantificación de las muestras expresa que se obtuvo una muestra pura
“La propiedad mas importante del DNA como depositario de la información genética es su secuencia de nucleótidos.”

Bibliografía

* Pierce Genetica un enfoque conceptual 2009 Ed. Medica Panamericana España.
* Voet Bioquímica 2006 Ed. Panamericana España.
* Nelson, Cox Lehninger: Principios de bioquímica 5ª 2009 ed. Omega España.





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