República Bolivariana de Venezuela
Instituto Universitario Politécnico
“Santiago Mariño”
Extensión C.O.L – Cabimas
Articulo Científico
Asignatura:
Química Analítica
Identificación por Cromatografía de Gases –
Espectrometría de Masas y determinación cuantitativa por Cromatografía
de Gases de los productos de degradación térmica de las tabletas
de policosanol (20 mg) revestidas.
Resumen.
Mediante Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas se
identificaron los estearatos y palmitatos de hexacosanilo, octacosanilo y triacontanilo
como
los principales productos de degradación térmica en las tabletas
de policosanol de 20 mg de ingrediente activo. Para cuantificar estos productos
de degradación se desarrolló y validó una
metodología por cromatografía de gases con detector de
ionización por llama, utilizando una columna capilar wide-bore BPX-5 (25
m X 0,53 mm d.i. X 1,0 µm de espesor de película) y estearato de
docosanilo como patrón interno, mediante un programa de temperatura
entre 300 y 350 °C . Al validar la metodología, esta mostró
buena exactitud y linealidad en un intervalo entre 2
y 30 % de degradación del
ingrediente activo. Los estudios de precisión realizados a este
método (repetibilidad y precisión intermedia) mostraron
coeficientes de variación menores del
2% en el analisis de tabletas con un 7 % de
degradación. Los límites de detección y
cuantificación encontrados para el palmitato de hexacosanilo, uno de los
ésteresminoritarios de la mezcla, (0,006 y 0,022 mg/tableta,
respectivamente) demostraron la posibilidad de emplear esta metodología
para el analisis de tabletas con menos de un 2 % de degradación,
ademas de obtener buena precisión y recobrado en el
analisis de tabletas contaminadas con palmitato de hexacosanilo en una
concentración correspondiente al límite de cuantificación.
El método puede ser utilizado como soporte en los estudios de
estabilidad de dichas tabletas.
Introducción
El policosanol es un ingrediente activo hipolipemiante
y antiplaquetario compuesto por una mezcla de alcoholes alifaticos primarios
de alto peso molecular. Su componente principal es el
1-octacosanol (C28), seguido por el 1-triacontanol (C30), el 1-hexacosanol
(C26) y otros alcoholes de alto peso molecular. La determinación
de los productos de degradación del
policosanol en sus formas terminadas debe ser realizada como apoyo a los estudios de estabilidad,
según se requiere actualmente por la Industria Farmacéutica para
los productos nuevos. Estudios realizados bajo condiciones drasticas de
almacenamiento a las tabletas de policosanol, con dosis de 5 y 10 mg, mostraron
que a elevadas temperaturas aparecen productos de degradación. Estos
fueron identificados por Cromatografía de Gases (CG) acoplada a
Espectrometría de Masas (EM) como los palmitatos y estearatos
deoctacosanilo y triacontanilo en las tabletas de 5 mg, y como los palmitatos
de hexacosanilo, octacosanilo y triacontanilo y los estearatos de hexacosanilo,
octacosanilo y triacontanilo en las tabletas de 10 mg y se desarrollaron
métodos analíticos para su determinación por CG en dichas
formas farmacéuticas.
Materiales y métodos
Disoluciones
Se emplearon disoluciones patrones de referencia (DPR) de palmitatos de
hexacosanilo (96 %), octacosanilo (97,72 %) y
triacontanilo (97,27 %), así como
de estearatos de hexacosanilo (99,57 %), octacosanilo (99,29 %) y triacontanilo
(96,48 %) (CNIC, Ciudad de La Habana,
Cuba) a 0 mg/mL en n.hexano (Merck,Alemania). Se empleó una
disolución de patrón interno (DPI) de estearato de docosanilo (99 %) (CNIC, Ciudad
de La Habana, Cuba también a 0,5 mg/mL en n.hexano (Merck, Alemania).
Se preparó, ademas, una disolución patrón de
trabajo (DPT), también en n-hexano, con la composición siguiente:
palmitato de hexacosanilo a 0,13 mg/mL; palmitato de octacosanilo a 1,2 mg/mL;
palmitato de triacontanilo a 0,32 mg/mL; estearato de hexacosanilo a 0,01
mg/mL;estearato de octacosanilo a 0,77 mg/mL y estearato de triacontanilo a
0,17 mg/mL . Se empleó también
Nmetil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida (MSTFA, Sigma, EUA) como agente derivatizante para los alcoholes del policosanol.
Equipos
Se empleó un cromatógrafo de gases modelo GC 14B (Shimadzu,
Japón) con detector de ionización por llama, acoplado a un
sistema de cómputo,y equipado con una columna capilar con faseenlazada
BPX-5 (25 mX 0,53 mm d.i. X 1,0 µm de espesor de película, SGE,
Australia). Programación: de 300 a 350 ºC a 10 ºC/min y 10 min
isotérmico a la temperatura final. Flujo del gas portador
(hidró-geno): 13 mL/min. Para
la formación de la llama se empleó hidrógeno a 40 mL/min y
aire a 400 mL/min. El detector y el inyector se calentaron a 350 ºC. El
volumen de inyección fue 1 µL. Se empleó un
cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas GC
8000 Series MD800 (Fisons Instruments, Inglaterra), con un sistema de
cómputo y equipado (25 m X 0,32 mm d.i. X 0,25 µm de espesor de
película, Supelco, USA). Programación: de 100 a 200 ºC a 40
ºC /min, de 200 a 320 ºC a 10 ºC/min y 30 min isotérmico
a la temperatura final. El flujo de gas portador (helio) fue 1 mL/min . Las temperaturas del inyector, la
fuente y la interfase fueron 300, 250 y 300 ºC, respectivamente. La
energía de ionización fue de 70 eV. El espectro de masas se
obtuvo de forma continua de 40 a 800 m/z.
Degradación de las tabletas
Se tomaron aleatoriamente 60 tabletas, seleccionadas a partir de tres lotes (20
tabletas de cada uno), las cuales fueron sometidas a degradación
acelerada por termólisis, a 108 °C durante 24 h en una estufa con
temperatura controlada.
Preparación de la muestra
Se tomaron aleatoriamente 20 tabletas degradadas, se pesaron y se les
determinó el peso promedio, que oscila alrededor de 176 mg. Se
trituraron en el mortero hasta obtener un polvo fino y homogéneo. En un
tubo de ensayos se pesó, con unaexactitud de 0,1 mg, alrededor del peso
promedio de la tableta, se le añadieron 3 mL de la DPI. Se
calentó a 60 °C, con agitación ocasional, durante 15 min. Se
filtró en caliente por un papel de filtro (Whatman No. 1; Maidstone,
UK), una alícuota de 500 µL y se transfirió a un vial de
1,8 mL, al que se adicionaron 50 µL de MSTFA. Se calentó durante 15 min a 60 °C para derivatizar los alcoholes del ingrediente activo,
con lo cual se evitan adsorciones irreversibles de estos alcoholes en el
sistema cromatografico y se analizó por CG. Las masas
correspondientes a los productos de degradación se obtuvieron por el
método del
Patrón Interno de acuerdo con una ecuación.
Para la determinación de los factores
masicos de respuesta relativa (fim), 0 mL de
cada DPR se transfirieron a un vial de 1,8 mL, se evaporó a sequedad el
contenido a 60 ºC en corriente de aire y se le añadieron 0,2 mL de
la DPI. La disolución 10 min (n = 3), porciones de 1 mL fueron
analizadas por CG, y los fim fueron calculados otra ecuación.
Debido a la coelución del palmitato de octacosanilo con el estearato de
hexacosanilo, así como del palmitato de triacontanilo con el estearato
de octacosanilo, los fim de estos dos pares de ésteres se determinaron
al considerar tanto la suma de las areas como de las masas
añadidas, de esta manera, se determinó, de forma conjunta, la
masa total de los compuestos que co-eluyen como la sumatoria de sus masas
respectivas.
La masa total de los productos de degradación en las tabletas se
calculó por la sumatoriade las masas individuales de todos los analitos
determinados por CG: los palmitatos y estearatos de hexacosanilo, octacosanilo
y triacontanilo. Este resultado se corrigió teniendo
en cuenta la masa de la muestra y la masa promedio de las tabletas analizadas.
Validación del método
La precisión se determinó a través de los CV (%) obtenidos
en el estudio de repetibilidad (un analista en el
mismo día y equipo, n = 8) y en el estudio de precisión
intermedia (dos analistas en diferentes equipos, durante tres días, n =
3). Para comprobar si había diferencias
significativas entre los resultados se aplicaron las pruebas F de Ficher y t de
Student para p = 0 . Los CV fueron
evaluados según el criterio de Horwitz
Resultados y discusión
Identificación de los productos de degradación.
Las tabletas con dosis de 20 mg de policosanol, sometidas a condiciones de
estrés, mostraron la aparición de cuatro picos extras al ser
analizadas por CG, lo que indicó la ocurrencia de un
proceso de degradación. Se observó que las condiciones
cromatograficas empleadas permiten la separación de los
componentes del ingrediente activo, con tiempos inferiores a los 3 min y de los
productos de degradación, entre 4 y 8 min. Dados los mayores tiempos de
retención observados para los productos de degradación, estos no
interfieren con los componentes del ingrediente activo ni con el patrón
interno utilizado. Como se puede apreciar, el presente método permite el
analisis de los productos de degradación del policosanol en menos
de 10min, tiempo muy inferior al requerido por las metodologías
anteriores.6,7 Esto fue posible gracias al uso de la columna capilar con fase
enlazada seleccionada, la cual, ademas de mayor resolución,
inercia, y estabilidad química, permite el calentamiento a temperaturas
superiores a las empleadas en las versiones anteriores de este método,
lo que aumenta significativamente la velocidad de los analisis. Los
productos de degradación formados fueron identificados por CG.EM como:
(1) palmitato de hexacosanilo, (2) una mezcla de palmitato de octacosanilo y
estearato de hexacosanilo, (3) una mezcla de estearato de octacosanilo y
palmitato de triacontanilo y (4) estearato de triacontanilo. La
identificación se realizó por comparación de los espectros
obtenidos con los de compuestos similares de la espectroteca NIST y con los
espectros obtenidos para los patrones sintetizados. La formación de
estos productos de degradación térmica puede deberse a la
interacción del excipiente estearato de
magnesio, compuesto por una mezcla de estearato y palmitato de magnesio con los alcoholes del
policosanol. La presencia mayoritaria de los alcoholes de 26, 28 y 30
atomos de carbono en el policosanol hace que los ésteres
correspondientes a estos alcoholes sean los que se
formen en mayor proporción. La co-elución de los pares de
compuestos identificados en los picos 2 y 3 fue corroborado por
comparación con los cromatogramas de las disoluciones de referencia
individuales. En ninguno de los dos casos fue posible separar
estos paresde ésteres, pues la igualdad de sus masas moleculares y el
hecho de pertenecer al mismo grupo químico, los hace presentar
comportamientos cromatograficos muy similares. Para realizar los
estudios de linealidad y exactitud se hizo necesario preparar una
disolución patrón de trabajo (DPT), con los patrones
sintetizados, en una proporción similar a la que estos presentan en la
tableta degradada: 4 % de palmitato de
hexacosanilo; 44,77 % de palmitato de octacosanilo; 3,36 % de estearato de
hexacosanilo; 12,02 % de palmitato de triacontanilo; 28,69 % de estearato de
octacosanilo y 6, 25 % de estearato de triacontanilo. Para conocer esta
proporción, y debido a la coelución de algunos de los
ésteres de interés, se combinó el analisis por CG
de muestras de tabletas de gradadas con el de muestras sintetizadas por
reacción de los alcoholes patrones individuales con la mezcla de
palmitato y estearato de magnesio que forma el excipiente.
Conclusiones
Se identificaron los productos de degradación térmica de las
tabletas revestidas con dosis de 20 mg de policosanol como los palmitatos
de hexacosanilo, octacosanilo y triacontanilo, y los estearatos de
hexacosanilo, octacosanilo y triacontanilo. Se desarrolló y
validó una metodolog ía analítica por CG con columna
capilar, la cual resultó lineal, exacta, precisa y con adecuados
límites de detección y cuantificación, por todo lo cual
puede ser utilizada en la determinación de estos compuestos en las
tabletas degradadas como apoyo a los estudios de estabilidad.
