MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
A.8 COEFICIENTE DE REPARTO
1. MÉTODO

El método de frasco de agitación se basa en las líneas directrices de la OCDE (1).

1.1. INTRODUCCIÓN

Este método de ensayo incluye dos procedimientos distintos: el método de frasco de agitación y la cromatografía líquida de alta resolución (CLAR). El primero puede aplicarse cuando el valor de log Pow (véanse mas abajo las definiciones) esta en el intervalo de -2 a 4, y el segundo cuando esta en el intervalo de 0 a 6. Antes de llevar a cabo ninguno de los procedimientos experimentales es necesario obtener una estimación previa del coeficiente de reparto.

El método de frasco de agitación es aplicable sólo a sustancias esencialmente puras solubles en agua y n-octanol, y no es aplicable a productos tensoactivos (para los que debe darse su valor calculado o una estimación basada en las solubilidades en n-octanol y agua por separado).

1.2. DEFINICIONES Y UNIDADES

El coeficiente de reparto (P) se define como la relación de las concentraciones en equilibrio (ci) de una sustancia disuelta en un sistema bifasico consistente en dos disolventes considerablemente inmiscibles. En el caso del n-octanol y del agua

Pow = Cln-octanol / Clagual

El coeficiente de reparto (P) es, pues, el cociente de dos concentraciones: se indica generalmente en forma de su logaritmo decimal (log P).

1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA

Método de frasco de agitación
No esnecesario utilizar sustancias de referencia cada vez que se investiga una nueva sustancia. Deben servir esencialmente para comprobar de vez en cuando la eficacia del método y para comparar con los resultados obtenidos según otros métodos.
Se dispone de amplias listas de valores de log Pow de muchos grupos de productos químicos (2) (3). Si no se tienen datos sobre los coeficientes de reparto de compuestos relacionados estructuralmente, puede utilizarse entonces una calibración mas general, establecida con otros compuestos de referencia.

1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO

1.4.1. Método de frasco de agitación
Para determinar un coeficiente de reparto, es necesario conseguir un equilibrio entro los elementos constitutivos del sistema que se influencien mutuamente y determinar las concentraciones de las sustancias disueltas en las dos fases. Examinando la bibliografía existente sobre este tema, se encuentra que pueden utilizarse varias técnicas diferentes para resolver este problema, es decir, la mezcla completa de las dos fases, seguida de su separación, que permita determinar la concentración en equilibrio de la sustancia de ensayo.

1.5. CRITERIOS DE CALIDAD

1.5.1. Repetibilidad
Método de frasco de agitación
Para obtener un coeficiente de reparto preciso, se haran determinaciones por duplicado en tres series de condiciones de ensayo diferentes, pudiendo variar tanto la cantidad de sustancia especificada como la relación de volumen de los disolventes. Los logaritmos de losvalores determinados del coeficiente de reparto deberan situarse en un intervalo de ±0 unidades logarítmicas.

1.5.2. Sensibilidad
Método de frasco de agitación
El intervalo de medida del método esta determinado por el límite de detección del procedimiento analítico. Esto debe ser suficiente para evaluar los valores de log Pow en el intervalo de -2 a 4 (a veces, bajo ciertas condiciones, este intervalo puede ampliarse hasta un log Pow de 5), cuando la concentración del soluto en cada fase no sobrepase los 0, 01 moles por litro.

1.5.3. Especificidad
Método de frasco de agitación
La ley de reparto de Nernst sólo se aplica a temperatura, presión y pH constantes para las soluciones diluidas. Estrictamente se aplica a una sustancia pura dispersada entre dos disolventes puros. Los resultados pueden ser modificados por la aparición simultanea, en una o ambas fases, de varios solutos diferentes.

La disociación o la asociación de las moléculas disueltas se traduce en desviaciones respecto a la ley de reparto citada. Estas desviaciones se observan porque el coeficiente de reparto pasa a depender entonces de la concentración de la solución.

Debido a los múltiples equilibrios implicados, este método de ensayo no debe aplicarse sin corregir a los compuestos ionizables. Para estos compuestos debe considerarse la utilización de soluciones amortiguadoras en lugar de agua; el pH de la solución amortiguadora debe diferir del pKa de la sustancia al menos en una unidad de pHy hay que tener en cuenta la importancia de este pH para el medio ambiente.

1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

1.6.1. Estimación preliminar del coeficiente de reparto
El valor del coeficiente de reparto puede estimarse preferentemente mediante un método de calculo o bien, cuando sea adecuado, utilizando la relación de las solubilidades de la sustancia de ensayo en los disolventes puros.

1.6.2. Método de frasco de agitación
1.6.2.1. Preparación
n-octanol: la determinación del coeficiente de reparto debe hacerse recurriendo a un reactivo de calidad analítica.
Agua: utilizar agua destilada o bidestilada procedente de un aparato de cristal o de cuarzo. En el caso de compuestos ionizables, puede ser necesario utilizar soluciones amortiguadoras en lugar de agua.
Nota: Evitar el agua extraída directamente de un intercambiador de iones.

1.6.2.1.1. Presaturación de los disolventes
Antes de determinar un coeficiente de reparto, se saturan recíprocamente las fases del sistema de disolventes agitandolas a la temperatura de ensayo. Para realizar esto, es preciso agitar durante 24 horas, en un agitador mecanico, dos grandes frascos que contengan n-octanol puro de calidad analítica o agua, con una cantidad suficiente del otro disolvente y dejarlos reposar hasta que se separen las fases y se alcance el estado de saturación.

1.6.2.1.2. Preparación para el ensayo
El volumen del sistema bifasico debe llenar casi completamente el recipiente de ensayo para evitar cualquierpérdida de materia debida a la volatilización. La relación de volumen y las cantidades de sustancia que deben utilizarse se determinan de la siguiente manera:
-estimación preliminar del coeficiente de reparto (véase mas arriba),
-cantidad mínima de sustancia de ensayo requerida para el procedimiento analítico utilizado,
-límite de concentración maxima en cada fase 0 moles por litro.
Se efectúan tres ensayos. En el primero se utiliza la relación calculada de volúmenes de n-octanol y agua, en el segundo se divide por dos esta relación, y el tercero se multiplica por dos esta relación.

1.6.2.1.3. Sustancia de ensayo
Se prepara una solución de reserva en n-octanol presaturado con agua. La concentración de esta solución de reserva debe determinarse con precisión antes de utilizarla para determinar el coeficiente de reparto. Esta solución debera guardarse en condiciones que garanticen su estabilidad.

1.6.2.2. Condiciones de ensayo
La temperatura de ensayo debe mantenerse constante (±1 °C) y situarse en el intervalo de 20 °C a 25 °C.

1.6.2.3. Procedimiento de medida
1.6.2.3.1. Establecimiento del equilibrio de reparto
Para cada serie de condiciones de ensayo, preparar recipientes de ensayo por duplicado con las cantidades requeridas, cuidadosamente medidas, de los dos disolventes, así como la cantidad necesaria de solución de reserva.
Medir los volúmenes de las fases de n-octanol. Colocar en un agitador apropiado o agitar a mano los recipientes de ensayo. En casode usar un tubo para centrifugar, un método que se recomienda consiste en hacer girar rapidamente 180 grados alrededor de su eje transversal el tubo, de forma que el aire que pudiera haber quedado retenido atraviese las dos fases. La experiencia muestra que 50 giros de este tipo suelen ser suficientes para establecer el equilibrio de reparto. Para mayor seguridad, se recomienda hacer 100 giros en cinco minutos.

1.6.2.3.2. Separación de las fases
Cuando sea necesario para separar las fases, centrifugar la mezcla. Efectuar esta operación con una centrífuga de laboratorio mantenida a temperatura ambiente o, si se utiliza una centrífuga sin control de temperatura, equilibrar los tubos de centrífuga a la temperatura de ensayo durante por lo menos una hora antes del analisis.

1.6.2.4. Analisis
Para determinar el coeficiente de reparto, es necesario analizar las concentraciones de la sustancia de ensayo en las dos fases. Para ello, se puede extraer una alícuota de cada una de las dos fases de cada tubo, para cada serie de condiciones de ensayo, y analizarlas según el procedimiento elegido. Debe calcularse la cantidad total de sustancia presente en las dos fases y compararla con la cantidad introducida inicialmente.

La muestra de la fase acuosa debe tomarse por un procedimiento que reduzca al mínimo el riesgo de incorporar trazas de n-octanol: para ello se puede utilizar una jeringuilla de cristal con aguja intercambiable; en primer lugar hay que llenar parcialmente deaire la jeringuilla y a continuación expulsarlo lentamente mientras que se va introduciendo al mismo tiempo la aguja a través de la capa de n-octanol. Extraer un volumen adecuado de fase acuosa. Retirar rapidamente la jeringuilla de la solución y quitar la aguja. El contenido de la jeringuilla se podra utilizar entonces como muestra acuosa. La concentración en las dos fases diferentes debera determinarse, preferentemente, mediante un procedimiento específico de la sustancia. Algunos ejemplos de métodos analíticos que pueden ser adecuados son:

-métodos fotométricos,
-cromatografía en fase gaseosa,
-cromatografía líquida de alta resolución.

1. RESULTADOS

Método de frasco de agitación
La fiabilidad de los valores determinados de P puede verificarse procediendo a una comparación de las medias de las determinaciones efectuadas por duplicado frente a la media general.

2. INFORME

El informe del ensayo incluira, a ser posible, la siguiente información:
-especificación precisa de la sustancia (identidad e impurezas),
-cuando no puedan aplicarse los métodos (p. ej., con productos tensoactivos), habra que dar un valor calculado o una estimación a partir de las solubilidades en n-octanol y agua por separado,
-toda la información y las observaciones que sean útiles para la interpretación de los resultados, especialmente en lo relativo a las impurezas y al estado físico de la sustancia.
Para el método de frasco de agitación:
-resultado de la estimaciónprevia, en su caso,
-temperatura de la determinación,
-datos sobre los procedimientos analíticos utilizados para determinar las concentraciones,
-tiempo y velocidad de la centrifugación, en su caso,
-concentraciones medidas en ambas fases en cada determinación (es decir, hay que indicar un total de 12 concentraciones),
-peso de la sustancia de ensayo, volumen de cada fase empleado en cada recipiente de ensayo y cantidad calculada total de sustancia de ensayo presente en cada fase tras el equilibrado,
-valores calculados del coeficiente de reparto (P) y media de cada conjunto de condiciones de ensayo, así como la media de todas las determinaciones. Si hay alguna indicación de que el coeficiente de reparto puede variar con la concentración, habra que señalarlo en el informe,
-desviación típica de los distintos valores de P respecto a su media,
-media del valor P de todas las determinaciones, expresada también en logaritmo decimal,
-valor teórico calculado de Pow cuando este valor se haya determinado o cuando el valor medido sea superior a 10|4|,
-pH del agua utilizada y fase acuosa durante la prueba,
-si se utilizan soluciones amortiguadoras, hay que justificar su uso en lugar del agua e indicar su composición, concentración y pH, así como el pH de la fase acuosa antes y después del ensayo.

Bibliografía
OCDE, París, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.
R. F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elservier, Amsterdam, 1977.