Consultar ensayos de calidad
Sintesis malónica: síntesis del acido 5-n-butilbarbitúrico
Practica1. Sintesis malónica:
síntesis del
acido 5-n-butilbarbitúrico
La síntesis malónica es un método llevado a cabo para la
obtención de compuestos con 1 o 2 sustituyentes en posición
α al carboxilo. En la primera etapa, una base arranca uno de los
hidrógenos α y el ion malonato obtenido actúa como
nucleófilo efectivo que desplaza al buen grupo saliente unido al grupo
carbonilo o arilo que se agrega en la segunda etapa. Finalmente, en la tercera
etapa se agrega un acido y se calienta para
hidrolizar el malonato y para catalizar la descarboxilación del acido
malónico generado. La síntesis malónica junto con la
síntesis acetoacetica, son dos importantes rutas de obtención de
compuestos diversos cuya característica son dos importantes rutas de
obtención de compuestos diversos cuya característica principal es
la presencia de uno o dos nuevos sustituyentes en la posición α al
carbonilo o carboxilo.
OBJETIVO
Vamos a llevar a cabo la síntesis del acido
5-n-butilbarbiturico. Para ello en primer lugar partiremos del malonato de
dietilo, el cual tiene propiedades acidas que derivan de sus
hidrógenos en posición α respecto al grupo carbonilo. Una
base puede captar uno de esos protones, dando lugar a un
anión, que puede experimentar reacciones de alquilación con un
derivado halogenado adecuado; nosotros utilizaremoscomo base el etóxido
sódico y como
derivado halogenado el 1-bromobutano. El producto obtenido condensa con urea
para obtener el acido 5-n-butilbarbitúrico, con el cual tenemos
que tener cierto cuidado en su manejo ya que es un
producto tóxico.
PARTE EXPERIMENTAL Y RESULTADOS
DIA1.
En un matraz de 100mL, añadimos 1,1g de etóxido sódico,
10mL de etanol absoluto y 0,28g de yoduro potasico. Finalmente
introducimos el agitador magnético y lo adaptamos a un
refrigentante provisto de un tubo de cloruro calcico. Al
colocar el matraz sobre la placa calefactora, calentamos y agitamos hasta
disolución total. Una vez que tenemos todo disuelto, por la parte
superior del
refrigerante, añadimos 2,2g de malonato de dietilo y se refuye durante
10 minutos. Seguidamente añadimos 1,3mL de 1-bromobutano por la parte
superior del
refrigerantey calentamos a reflujo durante 45 minutos. La reacción que
esta teniendo lugar es la siguiente:
5µl
20 µl
H2O
54 µl
TOTAL
100µL
*Cebadores a usar.
Posteriormente, se montaron 3 tubos: negativo, ADN genómico y ADN plasmídico
Sin ADN ADN genómico ADN plasmídico
Inicio del proceso
Las soluciones anteriormente preparadas se centrifugaron a 12000 r.p.m. durante
4 minutos (sin agregar el ADN), se le agrego el ADN a cada tubo y se centrifugó
de nuevo, seguidamente los tubos se ubicaron en el termociclador ( Fig.3.).
En el termociclador se programaron los ciclos de una PCR
típica, que son aproximadamente 30. La temperatura se eleva hasta 92ËšC
para la desnaturalización, desciende hasta 55ËšC para el alineamiento de los
cebadores y vuelve a elevarse hasta 72ËšC, que es la temperatura óptima para la
Taq polimerasa, la cual lleva a cabo el proceso de extensión y elongación de la
cadena de DNA.
Fig.3. Termociclador del CINBIN.
Finalmente se preparo un gel de agarosa teñido con
Bromuro de Etidio para realizar la electroforesis en gel y luego de los ciclos,
los productos obtenidos se depositaron en el gel donde también se deposito una
muestra positiva para comparar con las preparadas.
RESULTADOS
M N G P Po
Productos de la PCR. M marcador; N corresponde al
blanco, G ADN genómico, P ADN plasmídico y Po
es la muestra positiva.
DISCUSIÓN
Con base enlos productos observados en el gel electroforético, podemos observar
que las muestras si se amplificaron de forma correcta, en el segundo pozo no
observamos nada ya que era la muestra que no contenía ADN, entonces nada se
amplifico; pues a pesar que se tengan todos los componentes de la PCR, si no se
agrega el ADN que actuará como “molde”, no
se va a obtener ningún resultado, los pozos 3 y 4 contenían ADN y gracias a la
comparación con el marcador, puede que su peso sea de aproximadamente 600 bp, y
vemos que ambos fragmentos poseen pesos similares, comparando con la muestra
conocida (pozo 5) se ve que lo que se amplificó si es en realidad lo que se
estaba esperando y no otro ADN proveniente de una fuente externa por
contaminación de la muestra.
CONCLUSIONES
La PCR como técnica, es globalmente utilizada, esta tiene numerosas
aplicaciones médicas, genéticas y en la investigación forense; la PCR permite
obtener de manera rápida y relativamente fácil múltiples copias de un fragmento
determinado de DNA que tras la amplificación resultan mucho fácil para
identificar mediante electroforesis, como conclusión de la practica se observo
una correcta amplificación que no fue contaminada por ADN externo, uno de los principales
problemas de la técnica.
BIBLIOGRAFÍA
Case RJ, Boucher Y, Dahllöf J, Holmström C, Doolittle WF Kjelleberg.
2007. 'Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for
microbial ecology studies'. Appl. Environ. Microbiol. 73 (1):
278–88. doi:10.1128/AEM.01177-06. PMID 17071787. PMC 1797146.
Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed. edición). Cold Spring
Harbor, N.Y.: Cold Spring
Harbor Laboratory Press. ISBN 0-87969-576-5.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis
KB.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable
DNA polymerase. Science 239: 487–491
…
Utilizamos etanol
como
disolvente porque estamos trabajando con malonato de dietilo; si por ejemplo
utilizaramos metanol en su lugar podríamos llevar a cabo la
transesterificación. La función del KI es desplazar el
atomo de bromo en el derivado halogenado por uno de yodo que es mejor
gruposaliente, facilitando la
sn2 :
…
Una vez pasados los 45 minutos, obtenemos
un producto
con un aceite amarillosobre la superficie. Dejamos enfriar a temperatura
ambiente y rotamos hasta sequedad para la eliminación
del disolvente.
Continuamos añadiendo 15mL de agua y 0,25mL de HCl cc (tomamos los
0,25mL con ayuda de una pipeta
pasteur) y agitamos
hasta disolución total. Una vez enfriada la mezcla, la pasamos a
un embudo de decantación y se extrae sucesivamente
con dos porciones de 15mL de éter dietílico. La fase
organica la lavamos correctamente con 10mL de agua y 10 mL de NaHCO3 y
finalmente con otros 10 mL de agua. Una vez lavada, se seca sobre MgSO4 se
filtra y rotamos para la eliminación
del éter.
PREGUNTAAAR
DIA2.
En un matraz de 100mL añadimos 0,44g de etóxido sódico,
15mL de etanol absoluto, 1,1g de n-butilmalonato de dietilo (producto obtenido
anteriormente) y 0,35g de urea. Echamos el agitador magnético en el
matraz y lo adaptamos a
un refrigerante y un tubo de
cloruro calcico para evitar la entrada de humedad. Finalmente calentamos
y agitamos durante una hora y finalizado este tiempo introducimos por la boca
superior 10 mL de agua templada y 0,75mL de HCl cc. Esperamos hasta que la
mezcla se enfrie y se concentra hasta unos 10mL aproximadamente. La enfriamos
en
un baño de hielo y recogemos el
sólido formado por filtración a vacío. La reacción
de condensación que ha tenido lugar es la siguiente
PREGUNTAR
