UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
INSTITUTO DE QUÍMICA
TRABAJO DE GRADO
EXTRACCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS EN
THEVETIA PERUVIANA
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Químico
GRUPOS DE INVESTIGACIÓN
SÍNTESIS, REACTIVIDAD Y TRANSFORMACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS, SIRYTCOR, Y
BIOCONVERSIONES, UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA - SEDE MEDELLIN
TABLA DE CONTENIDO
Pagina
AGRADECIMIENTOS 4
1. INTRODUCCIÓN | 6 |
2. MARCO TEÓRICO | 8 |
3.1 Glicósidos Cardiotónicos2.1.1. Principios activos
cardiotónicos 2.1.2. Estructuras de las agluconas 3.2
Mecanismo de acción de los cardiotónicos2.2.1. Mecanismo
de acción inotrópica2.2.2.Contractibilidad Cardiaca 3.3 Efectos
secundarios2.3.1. Manejo de la toxicidad 3.4 Thevetia
Peruviana 3.5 Propiedades químicas 3.6 Resonancia Magnetica Nuclear 3.7
Cromatografia Liquida 3.8 Espectrometria de Masas | 991012121315161617182122 |
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS | 23 |4.9 General 4.10
Específicos | 2626 |
4. EQUIPOS | 28 |
5. METODOLOGÍA | 31 |
6.11 Recolección 6.12 Preparación de la muestra 6.13 Extracción 6.14 Análisis
cualitativo5.4.1.Desoxiazucares5.4.2. Anillo
esteroidal5.4.3. Anillo pentagonal de lactona 6.15
Cromatografía de Columna 6.16 Identificación 6.17 Cuantificación |
32333334343435373839 |
6. RESULTADOS Y DISCUSIONES 7.18 Identificación espectroscópica del Thevetin B 7.19
Cuantificación del Thevetin B 7.20 Estructura del Thevetin B | 40414751 |
7. CONCLUSIONES 8. PERSPECTIVAS 9.
PRODUCTIVIDAD 10. REFERENCIAS
BIBLIOGRAFICAS | 52545658 |
ABREVIATURAS | 61 |
AGRADECIMIENTOS
1. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN
La insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) aparece cuando el corazón es incapaz
de atender las necesidades del organismo mediante un
funcionamiento normal. El corazón aumenta de tamaño, pierde
fuerza de contracción y por tanto, la capacidad de bombear sangre con la
eficacia requerida.
El tratamiento clásico de la ICC va dirigido a reducir
los factores que la provocan y a mejorar la función del
miocardio, lo cual se puede alcanzar incrementando la eficacia por aumento de
la fuerza contráctil y el vaciado del
corazón con agentes inotrópicos positivos (cardiotónicos).
La especie vegetalThevetia peruviana, originaria de la América tropical y
naturalizada en la región del Valle de Aburrá sintetiza
metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos, los cuales almacena en
hojas y semillas. Esta premisa fue la motivación para llevar a cabo la
extracción, purificación, identificación y cuantificación de este
tipo de glicósidos presentes en la planta mencionada.
Los glicósidos cardiotónicos son de estructura esteroidal y se caracterizan por
llevar en el C-17 del núcleo esteroideo un anillo de
lactona insaturado. Las diferentes sustituciones del C-17 dan lugar
a diversas actividades o funciones, que son aprovechadas para la elucidación
estructural.
Entre los glicósidos cardiotónicos se encuentran los cardenólidos, productos
naturales que aparecen en diversas plantas, estos compuestos poseen un anillo pentagonal con un doble enlace conjugado con el
carbonilo en C-17. Además, ellos presentan azúcares como
sustituyentes, entre los más importantes se puede mencionar la glucosa y
6-desoxiazúcares (ramnosa, mucosa, digitalosa), así como 2 -desoxiazúcares
(digitoxosa, cimanosa).
El presente trabajo incluye el proceso de extracción sólido-líquido de los
glicósidos cardiotónicos de las hojas de Thevetia peruviana a través de una
metodología optimizada de separación y purificación, así como su respectiva
identificación estructural y cuantificación.
La cromatografía de columna fue la técnica implementada para la separación de
los componentes de la mezcla, en tanto que la elucidación estructural fue
alcanzada con la ayuda de la espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear
(1H- y 13C-RMN) y sucuantificación se logró mediante cromatografía de alta
resolución acoplada a masas, (HPLC-MS), permitiendo determinar por primera vez
la cantidad de principios activos presentes en estos compuestos.
Para las mediciones espectroscópicas y de cuantificación contamos con el apoyo
del Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de
Colombia – Sede Bogotá y del Laboratorio de de Cromatografía Líquida de la Sede
de Investigaciones Universitarias, SIU, de la Universidad de Antioquia.
2. MARCO TEÓRICO
2. MARCO TEORICO
2.1. Glicósidos cardiotónicos
Un cardiotónico es aquella sustancia que permite realizar al corazón
insuficiente el mismo trabajo con menor volumen, o sea, menor consumo de
oxígeno, o bien, mayor trabajo con el mismo gasto de energía, aumentando así la
eficiencia mecánica o tono del miocardio.
Todas las sustancias cardiotónicas son glucósidos ó derivados de ellos y se
encuentran en diversas plantas, de las cuales, la más importante es la digital,
es por eso que se denominan glucósidos cardiotónicos, glucósidos cardioactivos,
glucósidos digitálicos o glucósidos cardíacos.
2.1.1. Principios activos cardiotónicos
El principio activo de la planta a tratar son los glucósidos, los cuales son
sustancias que por hidrólisis dan origen a una porción
de azúcar o porción glucona (una o varias moléculas de monosacáridos) y otra
porción que corresponde al núcleo esteroidal y que se denomina aglucona o
genina, como se
muestra en la figura 1. En el caso de los glucósidos cardiotónicos, la aglucona
encierra la actividad farmacológica, mientras que el azúcar, inactivo de porsí,
rige la absorción, la penetrabilidad celular, la persistencia de la acción
cardíaca (fijación) y sobre todo la potencia farmacológica de dichos glucósidos
debido esencialmente a que los azúcares en unión con las agluconas aumentan su
liposolubilidad.
Figura 1. Porción glicona y aglucona de un glicósido
2.1.2. Estructura de las agluconas o geninas
Las agluconas de los glucósidos cardiotónicos pertenecen al grupo químico de
los esteroides, es decir, se derivan del ciclopentano perhidrofenantreno
denominado gonano, sistema anular común a un gran número de sustancias de
importancia farmacológica, entre las cuales sobresalen hormonas sexuales y
ácidos biliares, entre otras. En dichas agluconas existe una cadena lateral a
nivel del
carbono 17 en forma de un anillo lactónico no saturado. Estas geninas son de
dos tipos:
a) Cardenólidos: Se derivan del núcleo fundamental cardenólido, son esteroides
con 23 átomos de carbono, en donde el anillo lactónico es pentagonal y posee un
doble enlace entre las posiciones 20 y 22. La Figura 2, muestra la estructura
general de un cardenólido.
Figura 2. Estructura general de un cardenólido
b) Bufadienólidos: Son esteroides con 24 átomos de carbonos, en donde el anillo
lactónico es hexagonal y posee dos dobles enlaces, como se representa en la
figura 3.
Figura 3. Estructura general de un bufadienólido
Dicha estructura fundamental, sistema anular esteroide y anillo lactónico no
saturado es común para todas las agluconas cardioactivas, ellas además poseen
un radical hidroxilo en la posición 3 y otro en la posición 14; la unión de las
geninas con losazúcares para formar los glucósidos se realiza siempre a nivel
del hidroxilo en la posicion 3. Las diferencias entre las distintas agluconas
residen principalmente en el número y posición de los grupos hidroxilo y en el
hecho que algunos poseen un grupo formil en el carbono
19 en lugar de un grupo metílico
3.2. Mecanismo de acción de los glucósidos cardiotónicos
La acción esencial de los glucósidos cardioactivos y de aplicación médica es la
supresión de la insuficiencia cardíaca, lo cual es logrado gracias a las dos
propiedades fundamentales de dicha droga
a) Aumento de la fuerza de contracción sistólica
b) Aumento de la eficiencia mecánica o tono del miocardio
3.3.1. Mecanismo de acción inotrópica
Se ha postulado la existencia de un grupo de receptores para los glucósidos
cardiotónicos, los cuales rigen su acción inotrópica positiva o terapéutica,
que obedece a un incremento del proceso de acoplamiento de
excitación-contracción, dicho grupo de receptores se encuentra en la membrana
celular o sarcolema y sus prolongaciones.
De la unión del receptor con la droga resulta una inhibición del mecanismo de
la bomba de sodio a través de una acción depresora sobre la
adenosintrifosfatasa o ATPasa dependiente de sodio y potasio, que al desdoblar
el ATP provee la energía necesaria para el funcionamiento de dicha bomba; se
produce pues una mayor entrada de sodio en la célula durante la
despolarización, lo que implica un incremento de influjo del catión calcio
durante una segunda fase.
Por otra parte, el sodio al penetrar al sistema longitudinal (véase figura 4 y
5) delretículo sarcoplasmático libera un exceso de
calcio que junto al que ha ingresado se pone en contacto con el aparato
contráctil de la fibra miocárdica. Este exceso de calcio, provocado
indirectamente por los glucósidos cardiotónicos, al combinarse con la troponina
disminuye la inhibición del complejo tropomiosina-troponina sobre las proteínas
contráctiles; se produce pues un aumento de la interacción actina-miosina, con
mayor deslizamiento de sus filamentos debido a la producción de enlaces
químicos entre ellos y por ende, un incremento de la contracción o inotropismo.
3.3.2. Contractilidad cardiaca.
Las fibras del
miocardio propiamente dicho o contráctil son estriadas longitudinal y
transversalmente y están limitadas por la membrana celular o sarcolema.
Las proteínas contráctiles del miocardio son la actina y la
miosina; durante la contracción muscular los sarcómeros se acortan pero ni la
actina ni la miosina lo hacen, en su lugar estos dos juegos de filamentos se
deslizan uno sobre otro. Existen además dos proteínas moduladoras, la
tropomiosina y la troponina, durante la diástole la
primera inhibe la interacción entre la actina y la miosina, mientras que
durante el acoplamiento excitación-contracción, el calcio se combina con la
troponina, de manera que desaparece la acción inhibidora del complejo tropomiosina-troponina sobre
las proteínas contráctiles. La contracción del músculo cardíaco está generada por la
interacción entre las proteínas contráctiles del miocardio (miosina y actina) en
presencia de iones calcio.
Figura 4: Mecanismo de acción inotrópica
Figura 4. Contractibilidadaplicada
2
1
4
Ca++
3
Ca++
Ca++
Na+
K+
5
Ca++
Digitálicos
BCC
ï¢ï€ agonistas
Rianodina
Ca++ Sensibilizadores
4
Figura 5. Contractibilidad cardiaca
3.3. Efectos secundarios
Con relación a los efectos tóxicos de los glucósidos cardíacos, ellos
constituyen una extensión de los terapéuticos y lamentablemente no existe
ninguna droga cardiotónica desprovista de toxicidad.
Entre los principales síntomas asociados a la de toxicidad de los glucósidos
cardiotónicos se puede mencionar
Psiquiátricos:
Delirio, fatiga, malestar general, confusión, desvanecimiento y sueños
anormales. En el sistema nervioso central hay estimulación
vagal y quimiorreceptora.
Visuales:
Alteración de la visión, cromatopsia (percepción de los objetos con colores no
reales especialmente verde y amarillo), fotopsia (percepción de luces no
existentes) y la disminución de la agudeza visual; estos síntomas se atribuyen
al efecto de los digitálicos sobre sisoformas de la enzima ATPasa Na/K de las
células de la retina.
Gastrointestinales:
Anorexia, náuseas, salivación, vómito, dolor abdominal y diarrea, que son
causados por efecto directo sobre el tubo digestivo pero también por acciones
del sistema nervioso central, incluyendo estimulación de la zona de
desencadenamiento de quimiorreceptores.
Cardíacos
Aparición de perturbaciones del ritmo
cardíaco, efectos proarrítmicos (mediados por mecanismos tanto directos como neurohormonales),
entre los más comunes se pueden citar, despolarización ventricular prematura,
bigeminismo y bloqueo auriculoventricular de segundo grado, siendo las
extrasístolesventriculares las más comunes.
Otros:
La ginecomastía es un efecto poco común debido a la
acción estrogénica que se presenta en varones que toman digitálicos en forma
crónica. Así también, se conoce efectos respiratorios como la hipoxia
debida a un insuficiente suministro de oxígeno.
3.4.3. Manejo de la toxicidad:
El método para revertir la intoxicación se basa en la interrupción del tratamiento digitálico, es
importante destacar que no existe un antídoto específico, sin embargo se
dispone de un tratamiento que se divide en tres categorías:
1. Remoción gastrointestinal del
tóxico no absorbido.
2. Medidas de soporte destinadas a mantener la estabilidad hemodinámica, como
el suministro de cloruro de potasio o la aplicación de clorpromazina, si se
presentan vómitos.
3. Eliminación del tóxico absorbido.
3.4. Thevetia peruviana
Seguidamente se detallan algunas características específicas de la especie
vegetal de estudio.
Familia: Apocynáceae
Sinónimos: Cerbera peruviana , Thevetia neriifolia
Nombre común: Catape, cascabel, azuceno
Lugar de origen: México y América tropical
Etimología: Thevetia, en honor a André Thévet (1502-1590), misionero francés
que colectó plantas en Suramérica. Peruviana, del latín
peruvianus-a-um, procedente de Perú.
Cultivo y usos: Se multiplica por semillas, es una planta de rápido crecimiento
y muy resistente a condiciones adversas. Se suele cultivar más como arbusto que como árbol. Su látex y
semillas son venenosas. Las hojas y semillas contienen glucósidos que
actúan como
estimulantes cardíacos; aunque es utilizada en medicinapopular su empleo
inadecuado es muy peligroso.
Los criterios para la selección de la Thevetia peruviana que
se utilizará en el presente trabajo de grado se basaron en su disponibilidad
geográfica y en el alto contenido de glicósidos cardiotónicos reportado para
esta familia.
Figura 6. Thevetia peruviana
3.5. Propiedades químicas
Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos corresponden a las esperadas
de su estructura y considerable tamaño, así, ellos son sólidos cristalizables,
insolubles ó poco solubles en agua, solubles en alcoholes y en cloroformo.
La solubilidad depende de la naturaleza de la aglucona y de la cadena de
azúcares, entre mayor sea el número de residuos de azúcar, mayor será la
solubilidad.
2.6 RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR
La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica empleada
principalmente en la elucidación de estructuras moleculares.
Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo
magnético externo absorben radiación electromagnética en la región de las
frecuencias de radio o radiofrecuencias. Como la
frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de
estos núcleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molécula en
donde se encuentran éstos.
Para que se pueda emplear la técnica los
núcleos deben tener un momento magnético distinto de
cero. Esta condición no la cumplen los núcleos con número másico y número
atómico par (como
el 12C, 16O, 32S). Los núcleos más importantes en química orgánica son: 1H,
13C, 31P, 19F y 15N. Otros núcleos importantes: 7Li, 11B, 27Al, 29Si, 77Se,
117Sn, 195Pt, 199Hg, 203Tl, 205Tl, 207Pb.Se prefieren los núcleos de número
cuántico de espín nuclear igual a 1/2, ya que carecen de un momento magnético
cuadrupolar que produce un ensanchamiento de las señales de RMN. También es mejor que el isótopo sea abundante en la naturaleza, ya que
la intensidad de la señal dependerá de la concentración de esos núcleos
activos. Por eso, uno de los más útiles en la
elucidación de estructuras es el 1H, dando lugar a la espectroscopia de
resonancia magnética nuclear de protón. También es importante en química
orgánica el 13C, aunque se trata de un núcleo poco
abundante y poco sensible.
Figura 7. Esquema funcionamiento del equipo de RMN |
El espectrómetro de RMN (Figura 7) consta en forma general de cuatro partes . Un imán estable, con un
controlador que produce un campo magnético preciso.2. Un
transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas.3. Un detector para medir la absorción de energía de
radiofrecuencia de la muestra.4. Un ordenador y un
registrador para realizar las gráficas que constituyen el espectro de RMN. |
Para obtener un espectro de RMN, se coloca una
pequeña cantidad del compuesto orgánico
disuelto en medio mililitro de disolvente en un tubo de vidrio largo que se
sitúa dentro del campo magnético del aparato. El tubo con
la muestra se hace girar alrededor de su eje vertical.En los aparatos modernos
el campo magnético se mantiene constante mientras un
breve pulso de radiación rf excita a todos los núcleos simultáneamente. Como el corto pulso de
radiofrecuencia cubre un amplio rango de frecuencias
los protones individualmente absorben la radiación de frecuencianecesaria para
entrar en resonancia (cambiar de estado de espín). A medida
que dichos núcleos vuelven a su posición inicial emiten una radiación de
frecuencia igual a la diferencia de energía entre estados de espín. La
intensidad de esta frecuencia disminuye con el tiempo a medida que todos los
núcleos vuelven a su estado inicial.Un ordenador recoge la intensidad respecto
al tiempo y convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia, esto es
lo que se conoce con el nombre de transformada de Fourier (FT-RMN). Figura 8. Equipo de Resonancia Magnetica
Nuclear 2.7. CROMATOGRAFIA LIQUIDALa Cromatografía líquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography
(HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en
bioquímica y química analítica. El HPLC es una técnica utilizada para separar
los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.En la HPLC
isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con
ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de
líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la
naturaleza del compuesto, de la composición de la faseestacionaria y de la fase
móvil. El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido
de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad
identificativa y característica de un compuesto en una determinada fase móvil y
estacionaria. La utilización de presión en este tipo
de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la
columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución
de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el
agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones,
sales, o compuestos como
el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.Figura
9. Equipo de cromatografia liquida Agilent |
2.8. ESPECTROMETRIA DE MASAS
La espectrometría de masas es una técnica experimental que permite la medición
de iones derivados de moléculas. El espectrómetro de masas es un instrumento que permite analizar con gran precisión la
composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los
núcleos atómicos en función de su relación masa-carga (m/z). Puede utilizarse
para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto, o para determinar el contenido isotópico de
diferentes elementos en un mismo compuesto. Con frecuencia se encuentra como detector de un cromatógrafo de gases, en una técnica
híbrida conocida por sus iniciales en inglés, GC-MS
El espectrómetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un haz
de material del
compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos. El haz
de iones produce un patrón específico en eldetector,
que permite analizar el compuesto.
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2. HIPÓTESIS
Dado que muchas reacciones y compuestos que intervienen en el metabolismo en
los diferentes grupos de organismos vivos son casi idénticos, se les denomina
reacciones y productos metabólicos primarios. Sin embargo, una amplia
variedad de rutas bioquímicas son exclusivas de unas pocas especies de
organismos y se conocen colectivamente como “metabolismo secundario”, y a los
compuestos generados como metabolitos secundarios, los cuales usualmente son
señalados por los químicos como “productos naturales”.
La formación de productos naturales es una característica común de células
especializadas, originada por la acción de enzimas específicas que juegan un papel decisivo en el desarrollo y función del organismo productor como un conjunto. Actualmente se reconoce que
muchos de estos compuestos desempeñan un papel vital como mediadores de
interacción biológica, asegurando la supervivencia de un organismo en un medio
hostil y competitivo. Tales interacciones incrementan el interés por el estudio
de los productos naturales, imprimiendo a este campo
un carácter interdisciplinario, que abarca la química, la biología y la
botánica, entre otras áreas. La razón principal de estos estudios radica en la
utilización de los productos naturales en medicina, conduciendo a la búsqueda
de nuevas plantas potencialmente útiles por parte de químicos y biólogos, así
como de compañías farmacéuticas que enfocan sus investigaciones en las
propiedades de plantas muy reconocidas en la medicina popular.
Con relación a las enfermedades cardíacas,la
frecuencia de cardiopatías congénitas constituye un problema de salud que va en
aumento en la medida que la población es más longeva; para su tratamiento se
utilizan glicósidos cardiotónicos, especialmente cardenólidos, causando un
efecto que se manifiesta en el sistema cardiovascular ocasionando el aumento de
la contracción sistólica, lo que se denomina acción inotrópica positiva.
Los glicósidos cardiotónicos están presentes en especies vegetales de las
familias de las Apocynáceas y Asclepydáceas, donde la especie vegetal más
importante e investigada para el tratamiento de enfermedades relacionadas con
el corazón es la Digitallis purpurea2, conocida como Digital, de la cual se
extraen compuestos como la digitoxina que posee una gran cantidad de estos
cardenólidos encaminados a producir el efecto inotrópico positivo mencionado.
Kyeremematen y Hagos3, de la Facultad de Farmacia del Centro Biomédico Uppsala
en Suecia, realizaron un estudio de los compuestos presentes en las especies
Thevetia ovata y Thevetia nereifolia, encontrando tres glicósidos cardiotónicos
tipo cardenólido, para los cuales se caracterizó una estructura formada por un
anillo esteroidal y residuos de glucosa en la posición del C-3 y un compuesto
lactonizado en la posición del C-17.
En este marco de referencia y señalando que pese al gran interés práctico de
las plantas de Thevetia peruviana, el estudio de su química ha sido muy limitado,
el presente trabajo de investigación centra su interés en el estudio de los
compuestos químicos presentes en las hojas de la especie vegetal Thevetia
peruviana, perteneciente a la familia de lasApocynáceas, originaria de la
América tropical y naturalizada en el Valle de Aburrá. Se
espera que los metabolitos secundarios aislados puedan ser aprovechados a
futuro en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Acorde con estas expectativas se han fijado los siguientes objetivos:
3.1 OBJETIVO GENERAL
Extraer, purificar, identificar y cuantificar los glicósidos cardiotónicos
presentes en las hojas de la especie vegetal Thevetia peruviana, naturalizada
en la región del Valle de Aburrá.
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
* Seleccionar y adecuar un método eficiente para la
extracción y purificación de los glicósidos cardiactivos existentes en las
hojas de Thevetia peruviana.
* Utilizar ensayos conocidos para la identificación cualitativa de las partes
componentes de los glicósidos cardiotónicos.
* Llevar a cabo la identificación estructural de los compuestos de interés con
la ayuda de técnicas espectroscópicas convencionales.
* Cuantificar mediante cromatografía HPLC-Masas la cantidad de metabolitos
cardiotónicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana con el fin de
disponer de estándares puros de glicósidos cardiotónicos de esta especie, aún
no disponibles y que serán de gran ayuda como indicadores en la identificación
de cultivos provenientes de esta planta.
4. EQUIPOS
Figura 10. Rotaevaporador
Figura 11. Muestras extraidas y purificadas listas a
analizar
Figura 12. Cromatografía de columna
Figura 13. Esquema de la cromatografía de columna
Figura 14. TLC (Thin Layer Chromatography
5. METODOLOGIA
5. METODOLOGIA
La secuencia de etapas quepermitieron extraer, separar, purificar y cuantificar
los glicósidos cardiotónicos presentes en las hojas de Thevetia peruviana, se
esquematizan en el diagrama 1 (ver final del capítulo).
Después de un tratamiento preliminar de la muestra se efectuó un tamizaje fitoquímico,
etapa inicial de toda investigación fitoquímica que permite determinar
cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos
(fundamentalmente metabolitos secundarios) presentes en una planta, y a partir
de esta información, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los
extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. Específicamente, el tamizaje fitoquímico consiste en la extracción
de los componentes químicos de la planta con disolventes apropiados y la
aplicación de reacciones de coloración que permitan la evaluación rápida,
sensible, reproducible y de bajo costo de los mismos.
El desarrollo de la secuencia de etapas específicas de la metodología
implementada se describe a continuación.
5.1. Recolección y tratamiento preliminar de la muestra
La recolección del material vegetal se llevó a cabo en las riberas de la
quebrada La Iguana, localizada en el sector urbano de la ciudad, en cercanías
de la Universidad Nacional de Colombia – Sede Medellín.
La Thevetia peruviana es un arbusto de 3 a 5 m de
altura, con la corteza grisácea, lenticelada, algo rugosa con los años. Hojas
de linear-lanceoladas a lanceoladas, de 10-15 x 0 -1,2
cm, con la base atenuada, el margen entero y el ápice corta o largamente
acuminado; son glabras, algo coriáceas, de color verde lustroso en el haz, algo
más claras en elenvés, con el nervio central destacado y la nerviación
secundaria poco visible.
Después de su respectivo lavado, se procedió a su secado durante
dos días a temperatura ambiente, luego se trituró de tal forma que el material
vegetal tuviera un tamaño promedio de 0.5 cm.
5.2. Preparación de la muestra
En esta etapa se incluyeron los procesos de licuado, filtración desgrasado,
lavado, cromatografía de capa delgada y rotaevaporación, que se detallan
seguidamente.
Licuado: 250 g de hojas de Thevetia peruviana (TP) previamente seca y triturada
se someten a un licuado con 400 mL de éter de petróleo
durante 10 minutos para aumentar el área superficial y así poder extraer la
mayor cantidad de cardenólidos.
5.3. Extracción
Una vez que la TP se ha licuado, se procede a realizar una filtración al vacío
para recolectar el extracto etéreo y eliminar los residuos de las hojas.
Dicho concentrado se lavó tres veces con metanol en una relación de volumen
(metanol / éter de petróleo) 3:1 para retirar las grasas en suspensión que se
forman durante este proceso y que son retenidas en un
embudo de separación buchner.
Después se concentran las muestras por medio de rotaevaporación y se realiza un seguimiento de los compuestos por medio de cromatografía
de capa fina para verificar la presencia de los cardenólidos en la muestra.
5.4. ANALISIS CUALITATIVO
Después del lavado y una filtración al vacío se debe comprobar la existencia de
cardenólidos en el compuesto extraído, para ello se realizó un
análisis cualitativo.
Para comprobar de forma cualitativa la
presencia de cardenólidos en el extractoobtenido, se realizaron los siguientes
ensayos con reacciones coloreadas:
* Presencia de azúcares (desoxiazúcares).
* Presencia del núcleo esteroideal.
* Reacciones del anillo de lactona.
5.4.1. Desoxiazúcares
Para comprobar la presencia de azúcares utilizamos la reacción de Keller
Killiani:
En un tubo de ensayo se disuelve un poco del extracto metanólico
(1 mL) en ácido acético con algo de tricloruro de hierro. Sobre
esta disolución se deja caer por las paredes ácido sulfúrico y tricloruro de
hierro. En la superficie de contacto aparece un
anillo pardo y una capa acética azul verdosa, que muestra la presencia de los
desoxiazúcares. Este ensayo resultó positivo para la muestra
analizada.
Reacción de Keller-Killiani
CH3COOH + FeCl3 + H2SO4 TP Color verde azul (Fase acética
5.4.2. Anillo esteroidal
Para comprobar la presencia del anillo esteroidal se llevó a
cabo la reacción Liebermann-Burchnard.
A 1 mL de muestra disuelta en etanol, se le adiciona anhídrido acético (5 mL) y
ácido sulfúrico concentrado (5 mL), recién preparados, se agita con acido
acético y se deja reposar en un baño de hielo. La
aparición de un color violeta verde es indicativo de
la presencia del
anillo esteroidal.
La reacción de Liebermann-Burchard se realiza en un
medio ácido fuerte constituido por ácido sulfúrico, ácido acético y anhídrido
acético. En la reacción, el esteroide sufre una oxidación gradual, formándose
en cada etapa una molécula de colestapolieno, que posee un
doble enlace adicional con respecto al compuesto del cual deriva. La etapa inicial de esta
reacción consiste en la protonación delgrupo OH del colesterol con la consiguiente
pérdida de agua, obteniéndose el ión carbonio 3 -colestadieno
que constituye el primer paso de la reacción del color. La oxidación secuencial de este ión carbonio alílico por el SO2- produce un ácido
colesta-hexano-sulfónico con características cromofóricas.
Al igual que en los pruebas anteriores, este ensayo
arrojó un resultado positivo sobre la muestra de estudio.
5.4.3. Anillo pentagonal de lactona
Reactivo de Raymond-Marthoud.
Este reactivo se prepara a partir de 1 g de m-dinitrobenceno
en 100 mL de etanol y la adición de hidróxido de potasio. La presencia
de un color violeta confirma la estructura del anillo lactónico.
Reactivo de Kedde
Para preparar este reactivo se requiere ácido 3 -dinitrobenzoico
(al 3% en metanol) y la adición de hidróxido de potasio (al 6% en H2O). Un color rojo violeta señala la presencia del anillo lactónico.
Estos dos ensayos también dieron resultados positivos, confirmando la presencia
del
anillo lactónico.
5.5. Cromatografía de columna
5.5.1. Separación a través de cromatografía de columna
Con el extracto vegetal concentrado se realizaron placas cromatográficas con
diferentes combinaciones de solventes para poder determinar la mejor separación
de los compuestos de interés, el mejor resultado fue obtenido para la relación
tolueno/acetato de etilo (3:1).
Con esta combinación de solventes y con el fin de separar los compuestos del
extracto vegetal, ese efectuó el montaje de columnas cromatográficas con silica
gel 60, en tanto que la cromatografía de capa fina fue utilizada para controlar
la purezade las fracciones obtenidas.
Al realizar la columna cromatográfica se observan dos franjas bien
diferenciadas por su color, de la primera franja de color verde oscuro se
recolectaron las fracciones 3-11, las cuales dieron lugar a un compuesto puro. Las placas cromatográficas de las fracciones 12-23, no presentaron
ningún compuesto.
La segunda franja de color pardo, correspondiente a las fracciones 24-30
presentó impurezas en las placas cromatográficas tomadas en tolueno/acetato de
etilo (3:1), por lo que se procedió a realizar una
nueva columna cromatográfica modificando la proporción de disolventes
(tolueno/acetilo de etilo en relación de volumen 5:1) dando un compuesto puro,
pero en cantidad mínima.
Las dos muestras fueron rotuladas y enviadas al laboratorio
de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de Colombia – Sede
Bogotá para su identificación espectroscópica.
Tol/Ac.3:1
| Tol/Ac.3:1
Figura 15. Esquema para la Cromatografía de columna en la extracción
de Thevetia peruviana
5.6. Identificación
Condiciones de Medición
Los espectros de resonancia magnética nuclear 1H- y 13C-RMN fueron tomados en
CDCl3 en un espectrofotómetro Bruker Avance 400 MHZ,
en el Laboratorio de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad Nacional de
Colombia – Sede Bogotá. Los desplazamientos químicos son reportados en ppm
utilizando TMS como
estándar.
5.7. Cuantificación
Equipo
Se utilizó un Cromatógrafo Líquido Agilent 1200, con detector de arreglo de
diodos (DAD) a una longitud de onda de 220nm, acoplado a un espectrómetro de
masas tipo cuadrupolo simple G1956A,equipado con una cámara de ionización tipo
ES-API y operado en modo scan (200-1000m/z).
Análisis
Para lograr la separación se utilizó una columna C18( 20cm x6.4 mm) mantenida
durante el análisis a 25 C, 10µL de la muestra fueron
inyectados utilizando un sistema automático de muestreo y eluidos con
una fase móvil que consistió de acetonitrilo-agua (30:70). El flujo fue de
0.5ml/min.
Fueron preparadas soluciones estándar de 40, 60, 80, 100 y 120 ppm de
peruvósido que fueron inyectados directamente en el sistema HPLC en el anterior
orden. Para calcular la curva de calibración utilizamos el área de pico del peruvósido,
obteniéndose una coeficiente de correlación de 0.9905 y la ecuación fue de
Y=6.25X + 305 .
Concentración (ppm) | Área |
40 | 554 |
60 | 710 |
80 | 765 |
100 | 936 |
120 | 1066 |
6. RESULTADOS Y DISCUSIONES
6.1. Identificación
Resultados
La caracterización espectroscópica de los cardenólidos se apoya principalmente
en la resonancia magnética nuclear de protones y carbono (1H- y 13C-RMN), en la
espectrometría de masas y en los espectros simulados; es de resaltar que todas
las señales experimentales concuerdan con las predichas. Dado que el
glicósido Thevetin A solo puedo aislarse en una cantidad mínima, que permitió
la comprobación de su estructura por medio de masas, la discusión de resultados
está referida a la molécula de Thevetin B. En la tabla 1 se presenta la
información espectral reportada previamente para este compuesto.
Tabla 1. Datos espectroscópicos de
1H- y 13C-RMN reportados para el cardenólido.
C | δC | H | δH | C | δC | H | δH |
1 |26.89 | 1a1b | 1.821.42 | 13 | 50.42 | 13 | --- |
2 | 27.01 | 2a2b | 1.611.51 | 14 | 85.90 | 14 | --- |
3 | 72.20 | 3 | 4.05 | 15 | 29.86 | 15a15b | 1.621.48 |
4 | 35.03 | 4a4b | 2.151.60 | 16 | 27.38 | 16a16b | 2.151.74 |
5 | 74.50 | 5 | --- | 17 | 51.84 | 17 | 2.74 |
6 | 32.04 | 6a6b | 1.951.70 | 18 | 18.42 | 18 | 1.00 |
7 | 17.60 | 7a7b | 1.511.38 | 19 | 12.10 | 19 | 0.87 |
8 | 36.94 | 8 | 1.79 | 20 | 174.30 | 20 | --- |
9 | 35.54 | 9 | 1.76 | 21 | 73.37 | 21a21b | 4.984.80 |
10 | 35.19 | 10 | --- | 22 | 117.9 | 22 | 5.85 |
11 | 22.47 | 11a11b | 2.101.10 | 23 | 174.2 | 23 | --- |
12 | 40.38 | 12a12b | 1.571.38 |
En forma general y a pesar del gran número de protones (Figura 17), se aprecia
cuatro grupos señales, el primero entre δ = 0.9 y 1.82 ppm,
correspondiente a los protones del anillo A a excepción del H-3, los del anillo
B, y un protón de las posiciones C-11 y C-12 del anillo C, incluyendo los
grupos metílico de las posiciones C-18 y C-19. El segundo grupo de señales se
extiende de δ = 2.02 a 2.38 ppm y corresponde a uno de los protones
metilénicos de las posiciones C-4, C-11 y C-16 y al protón metínico del
C-17. Entre δ = 4.5 y 4.7 ppm se observa un
multiplete para los protones metilénicos del
C-21 y el metínico del C-3, ubicados en esta
posición debido al efecto desprotector del
grupo ester cíclico y del
grupo hidroxilo respectivamente. Finalmente, un
multiplete a δ = 5.16 ppm correspondiente al protón olefínico del C-22, cuyo acoplamiento a larga distancia con el
grupo metilo del
C-18 que ha sido reportado previamente5.
Con respecto a las señales de losazúcares, dos anillos de glucosa y un tercero de thevetosa, ellas se pueden asociar en tres
grupos, un multiplete que aparece entre δ = 3.24 y a 3.45 ppm atribuido a
los protones de los posiciones C-2´, C-3´y C-4´. Otro multiplete entre δ =
3.69 y 3.76 ppm de los protones de C-5´y C-6´. El tercer multiplete a δ =
4.55 ppm del
protón de la posición C-1´. En esta región aparecen además de
forma solapada las señales correspondientes a los grupos hidroxilos (OH), CH2OH
y CH3 y CH3O.
Con relación al espectro de13C-RMN del Thevetin B (Figura 18), nuevamente
las señales encontradas concuerdan con las reportadas para este compuesto. En la tabla 2 se presentan los desplazamientos experimentales
registrados para la molécula en mención.
Así la señal del
carbonilo se registra a δ = 174.3 ppm, los 4 carbonos cuaternarios (C-20,
C-14, C-13 y C-10) aparecen a δ=71.5, δ=88.3, δ= 59.1 y δ=
35.2 ppm respectivamente. Los nueve carbonos metilénicos de los anillos A, B, C
y D aparecen en un rango comprendido entre δ=
17.6 ppm y δ= 40.4 ppm, mientras que el carbono metilénico del anillo lactónico (C-21) aparece desplazado
δ=79.0 ppm debido al efecto desprotector del grupo lactónico.
Por su parte, los carbonos metínicos (C-3, C-5, C-8, C-9 y C-17) se registran
en el rango esperado entre δ= 35.5 ppm y δ= 72.2 ppm, en tanto que el
CH vinílico (C-22) aparece a δ= 117.8 ppm. Los dos grupos metílicos (C-18
y C-19) aparecen según lo previsto a campo bajo, específicamente a δ= 18.4
ppm y δ= 25.4 ppm.
Tabla 2. Datos espectroscópicos de
1H- y 13C-RMN experimentales para el cardenólido.
C | δC | H | δH | C | δC | H | δH |1 | 26.89 | 1a1b |
1.821.032 | 13 | 59.122 | 13 | --- |
2 | 27.01 | 2a2b | 1.1671.055 | 14 | 88.270 | 14 | --- |
3 | 72.20 | 3 | 4.554 | 15 | 29.86 | 15a15b | 1.621.48 |
4 | 35.03 | 4a4b | 2.0811.60 | 16 | 27.38 | 16a16b | 2.0811.724 |
5 | 80.992 | 5 | --- | 17 | 68.181 | 17 | 2.384 |
6 | 32.04 | 6a6b | 1.951.70 | 18 | 18.42 | 18 | 0.835 |
7 | 17.60 | 7a7b | 1.1021.300 | 19 | 25.36 | 19 | 0.917 |
8 | 36.94 | 8 | 1.79 | 20 | 174.310 | 20 | --- |
9 | 35.54 | 9 | 1.76 | 21 | 79.030 | 21a21b | 4.7334.612 |
10 | 35.19 | 10 | --- | 22 | 117.846 | 22 | 5.159 |
11 | 22.47 | 11a11b | 2.0220.994 | 23 | 171.590 | 23 | --- |
12 | 40.38 | 12a12b | 1.6441.38 |
Desoxiazúcares de Thevetia peruviana
Experimentalmente, los resultados del análisis espectroscópico señala en la
especie vegetal de interés, la presencia de los siguientes azúcares:1
(α-L.thevetose) y 2 (β-D-Glucosa) en el siguiente orden:
Figura 16. Azúcares de Thevetin B
Desplazamientos protónicos 1H- y 13C-RMN experimentales de los desoxiazúcares
sustituyentes en la estructura de los cardenólidos
Tabla 3. Datos espectroscópicos de 1H- y 13C-RMN experimentales para los
desoxiazucares del
cardenólido.
Átomo del azúcar | 1H | 13C |
1’ | 4.554 | 103.876 |
2’ | 3.246 | 75.21 |
3’ | 3.254 | 78.25 |
4’ | 3.446 | 72.640 |
5’ | 3.697 | 77.85 |
6’ | 3.760 | 62.84 |
Figura 17. Espectro experimental de 1H-RMN para el
Thevetin B
Figura 18. Espectro simulado de 1H-RMN para el
Thevetin B
Figura 19. Espectro experimental de 13C-RMN para el
Thevetin B
Figura 20. Espectro simulado de 13C-RMN para
elThevetin B
6.2. Cuantificación
Resultados
Para la cuantificación del
analito por HPLC se utilizo el método del
Estándar Externo, que es sin lugar a dudas, el método de cuantificación más
utilizado en Cromatografia Líquida. El cual consiste en la preparación de
estándares de concentración semejante al analito en la muestra y en el ensayo
cromatográfico de ambas, muestra y estándar, en las mismas
condiciones operativas. La concentración del analito en la mezcla se determina
comparando el área de pico en cuestión con el área correspondiente al estándar
de referencia, es decir:
P= AmCs/As
Donde P es el porcentaje de analito de la muestra, Am y As son las aéreas de la
muestra y el estándar respectivamente y Cs es la concentración del estándar. La
concentración del
analito en la muestra puede obtenerse matemáticamente utilizando la ecuación
anterior o bien gráficamente utilizando una curva de calibración para ello17.
Teniendo en cuenta la similitud estructural, el estándar que se utilizó fue el
peruvósido, dado a que la molécula de thevetina no es comercialmente
disponible.
Nombre: Peruvoside
Formula: C30H44O9
Peso Molecular: 548.65
Estructura :
Figura 21 Estándar externo Peruvósido
Se prepararón soluciones estándar de 40, 60, 80, 100 y 120 ppm de peruvósido
que fueron inyectados directamente en el sistema HPLC en el anterior orden.
Para calcular la curva de calibración utilizamos el área de pico del peruvósido,
obteniéndose una coeficiente de correlación de 0.98753 y la ecuación fue de
Y=9,5875X + 75 .
Tiempo de Retención de la thevetina tR: 6.150 minutos|
Area 1 | Area 2 | Promedio | RSD | C.V |
Thevetina | 880 | 865 | 872.5 1.21% |
i
Figura 22. Cromatograma para la thevetina
Finalmente el espectro de masas permite confirmar la presencia del compuesto Thevetin B que se
había analizado por Resonancia Magnética Nuclear y por HPLC, mostrando un pico
intenso a m/z = 859.5 que corresponde al peso molecular del Thevetin B.
Figura 23. Espectro de masas del
Thevetin B
A partir del
mecanismo de fragmentación sugerido para el compuesto (Figura 24), podemos
observar que se presenta un pico correspondiente al ión molecular (m/z = 859
u.m.a), que es al mismo tiempo el pico base, en nuestro caso particular esta
señal confirmó la presencia de glicósido cardiotónico de interés. Adicionalmente, se registran otras señales correspondientes a la
posterior fragmentación de la molécula.
Figura 24. Mecanismo sugerido en la fragmentación del
cardenólido (REF
A partir del análisis de los espectros de RMN, los cromatogramas de HPLC y los
espectros de masas llegamos a la conclusión de que el metabolito secundario
presente en la Thevetia Peruviana del Área Metropolitana del Valle de Aburrá,
es el compuesto que en la literatura se denota como Thevetin B, que tiene la
siguiente estructura:
6.3. Estructura del
Thevetin B
Nombre: Thevetin B
Formula: C42H66O18
Peso Molecular: 858.4247
Estructura:
Figura 25. Molécula de Thevetin B
7. CONCLUSIONES
7. Conclusiones
1. Se comprobó la presencia de metabolitos secundarios
tipo glicósidos cardiotónicos en la planta de Thevetia peruviana naturalizada
en nuestra región.
2.Mediante técnicas tradicionales de separación y purificación como son, la
extracción, filtración y cromatografía en columna, se logró aislar y purificar
dos metabolitos secundarios tipo glicósidos cardiotónicos en las hojas de la
planta Thevetia peruviana, naturalizada la región de Antioquia. Su elucidación
estructural se efectuó con espectroscopia de RMN y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS) acoplado a masas.
3. Además, mediciones de UV-VIS permitieron la cuantificación del cardenólido
Thevetin B en la especie vegetal de estudio.
4. El método desarrollado para extraer y caracterizar los glicósidos
cardioactivos fue eficiente y condujo a resultado satisfactorios, por tanto
puede implementarse para el análisis de glicósidos cardiotónicos de otras
especies vegetales.
8. PERSPECTIVAS
8. PERSPECTIVAS
Con respecto a las principales perspectivas de este trabajo de grado, podemos
mencionar las siguientes
1. Lograr su aplicación en el sector productivo relacionado con la industria
farmacéutica mediante su implementación como materia prima para el desarrollo
de nuevos, sofisticados y efectivos medicamentos encaminados al tratamiento
eficiente de las enfermedades cardíacas, y con ello contribuir a mejorar la
calidad de vida de las personas que sufren este tipo de trastornos.
2. Otra de las grandes expectativas derivadas del presente
trabajo se enfoca en la producción a nivel biotecnológico de este tipo de
cardenólidos con el fin de disponer de cantidades considerables para múltiples
y posteriores usos.
3. De igual forma se pretende ampliar el conocimiento relacionado con lasaplicaciones
para este tipo de compuestos derivadas de propiedades
biológicas presentes en los mismos, las cuales han sido escasamente exploradas.
4. Continuar con la investigación relacionada con este tipo de metabolitos
secundarios en especies vegetales similares, específicamente con su
aislamiento, purificación y caracterización, con el propósito de confirmar su
presencia, abundancia, similitud y diferencias.
9. PRODUCTIVIDAD
10. PRODUCTIVIDAD
* Ponencia en modalidad de Póster en el XV Congreso Nacional de Química.
Bogotá. Octubre 29-31 de 2008.
* F. Amaringo, A. Hormaza y M. Zabala. “Extracción,
purificación, caracterización y cuantificación de los glicósidos carditónicos
Thevetin A y Thevetin B en la especie Thevetia peruviana”. Noticias
Químicas, ISSN 0120-2170, Vol 30, 82, 88, 2008.
* Presentación en Póster en la Semana de la Química, Escuela de Química –
Universidad Nacional de Colombia Nacional – Sede Medellín, Noviembre de 2008.
* Presentación oral “Extracción, identificación y cuantificación de glicósidos
cardiotónicos en Thevetia peruviana”, en el Encuentro REDCOLSI, Semilleros de
Investigación – Nodo Antioquia. Universidad Eafit, Mayo de 2007.
11. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
10. Referencias bibliográficas
1. Litter, M., Farmacologia experimental y clinica, Ed. El Ateneo, Sexta
Edición.
2. Medarde, M., Caballero, E., San Feliciano, A., Cardiopatías, Investigación y
Ciencia, Febrero (1997), 36-37.
3. Brunenton , Jean., (1993) Pharmacognosy,
Phytochemistry , medicinal plants, 915 p.
4. Takechi, M., Uno, C., Tanaka, Y. (1995),Structure-activity relationships of
synthetic cardiac glycosides, phytochemistry, Vol. 41, No. 1, pp. 125-127.
5. Hani, E., Atef, H., (1999), Complete 1H and 13C signal assignments of
5alfa-cardenolides isolated from Calotropis procera R.BR., Journal of Molecular
Structure 477,pp. 201–208.
6. El-askary, H., Holzl, J., El-sayeda, Hilal. (1994), A comparative study of
the cardenolide content of different organs of gomphocarpus sinaicus,
Phytochemistry, Vol. 38, No. 5, pp. 1181- 1184.
7. Luta, M., Hensel, A., Kreis, W. (1998),
Synthesis of cardenolide glycosides and putative biosynthetic precursors of
cardenolide glycosides, Steroids. Vol 64. pp. 44-49.
8. Abe, F., Iwase, Y., Yamauchi, T. (1995), Flavonol sinapoyl glycosides from
leaves of thevetia peruviana, Phytochemistry, Vol. 40, No. 2, pp. 577 581.
9. Kopp, B., Krenn, L., Draxler, Margit., Hoyer, A., (1996) Bufadienolides from
urginea maritima from Egypt, Phytochemistry, Vol. 42, No. 2, pp. 513-522.
10. Lei, Z., Yahara, S., Nohara, Toshihiro. (1996
Cardenolides from erysimum cheiranthoides, Phytochemistry, Vol. 41, No. 4, pp.
1187-1189.
11. Kamel, M.S., Assaf, M.H., Abe, Y., Ohtani, K. (2001) Cardiac glycosides
from Cryptostegia grandifora, Phytochemistry Vol. 58, pp. 537–542.
12. Abe, F., Chen, R.F., Yamauchi, T. (1996) Dinormonoterpenoids and their
apiosylglucosides from thevetia peruviana, Phytochemistry, Vol. 43. No. 1, pp.
161-163.
13. Lei, Z.H., Jin Z.H., Ma, Y.L., Tai, B.S., Kong, Q.(1998) Cardiac glycosides
from erysimum cheiranthoides, Phytochemistry Vol. 49, No. 6, pp. 1801-1803.14. https://es.geocities.com/qo_10_rmn/
14. Quattrocchi O; Abelaira S, Laba R.F. Introducción
a la HPLC. Aplicación y práctica. Editorial Artes gráficas.
Argentina. 1993. p
241 – 266.
ABREVIATURAS
ICC Insuficiencia Cardiaca Congestiva
HPLC High Performance Liquid Chromatography
MS Mass Spectrometry
RMN Resonancia Magnética Nuclear
TLC Thin Layer Chromatography
TP Thevetia peruviana
ATPasa Adenosintrifosfatasa
ATP Adenosintrifosfato
Gap Junction Unión Arterial
Thevetia peruviana
Licuado con éter de petróleo
Filtración al vacío
Desengrase con metanol
(por triplicado)
Filtración al vacío
Se dividió en dos fracciones
Se evaporó una fracción y se guardó
Se evaporó fracción y se realizó los análisis
Ensayos que confirman la presencia de cardenólidos
Columna cromatográfica con solvente Tol/Ac (3:1) para separar cardenólidos
Fracciones 3-11
Las fracciones mostraron la presencia de dos compuestos en muy poca cantidad y
con muchas impurezas.
Fracciones 24-30
Compuesto 2
Impuro
Compuesto 1
Puro
Columna cromatográfica (Tol/Ac 5:1)) que permitió
obtener el compuesto 2 puro
Placas cromatográficas con (Tolueno/Acetato de etilo (3:1),
muestran manchas impurezas
Análisis
Espectroscópico
RMN
Diagrama 1. Proceso de extracción de la Thevetia Peruviana
