Inmunización de un conejo con IgG de suero humano
HOYO-GARCÍA L.E., MORAN-OROZCO E.I., SAADIA-HARVY A.V., SANTIAGO-REYNAGA G.

Resumen
El sistema inmune es un complejo engranaje de células y compuestos que interactúan con la finalidad de defender al organismo de la colonización de otros que no sean de su conveniencia asi como de otras funciones importantes, como la destruccion de celulas viejas o con alteraciones geneticas. Por medio de varios experimentos (ELISA, Ouchterlony, Cromatografía, etc.) comprobamos la eficacia y eficiencia del sistema inmune, preferentemente su parte adaptativa. Para realizar el proyecto usamos un conejo con un sistema inmune intacto y lo inmunizamos contra suero humano, lo que crearía una reacción contra todas las proteínas humanas que tuviera el suero, nosotros cuantificamos específicamente la reacción contra los IgG. Para lograr la inmunización del conejo infectamos muestras de suero humano en el conejo sistematicamente (cada semana, durante 6 semanas) y también tomamos muestras sanguíneas para comprobar el progreso de su respuesta inmune contra los IgG humanos, se esperaba que existiera un aumento en la respuesta cada vez que se inyectara una nueva muestra, ya que el sistema inmune adaptativo mejora ante cada contacto con el antígeno.

Después de realizar los experimentos planeados se obtuvieron los siguientes resultados; el conejo creó una respuesta inmune contra los IgGscomprobado con la prueba de ouchterlony y que aumento progresivamente, esto comprobado con el ELISA, también se realizo un prueba de concentración de Ig con el método de cromatografía. Los métodos  y resultados estan desarrollados en el artículo.
Introducción
Las Ig son moléculas de glicoproteínas que funcionan como anticuerpos en la respuesta inmune (RI). Dependiendo de la localización de la infección, del tipo de infección, del antígeno presente, y de muchos factores las Ig que se producen son distintas, y cada una de las Ig’s tiene diferentes características. Las mas comúnes son las IgA, IgG e IgM. La IgG es la Ig mas abundante en el suero humano y la IgM es la primera Ig que produce el feto. Estas Ig se pueden cuantificar y medir mediante distintos métodos. Las inmunizaciones realizadas a los conejos, nos pueden ayudar a identificar Ig y la respuesta que se genera a ciertos antígenos , así com la magnnitud de la respuesta basada en la cantidad de Ig que se generaron. Para poder revisar esto se realizaron diferentes pruebas.
Una de las pruebas que se puede realizar es la de Ochterlony. Esta prueba sirve para detectra antígenos o anticuerpos de una muestra biológica. En esta prueba se ponen distantas muestras de el material biológico extraído (anticuerpos) y en el centro se coloca el antígeno (Ag) que se quiere encontrar o investigar. Existen tres reacciones de precipitación en esta prueba, identidadcompleta, incompleta o no identidad. Cada uno de estos precipitados nos indican si algun anticuerpo en los pozos exteriores interacciona con el antígeno en el pozo central. Si es una identidad completa se da una línea curva continua (Fig. 1), si es incompleta se da una línea continua curva con un espolón (Fig. 2), y si no tiene identidad se dan dos líneas entrecruzadas (Fig. 3).
Fig. 1, 2 y 3. Imagenes de los diferentes tipos de precipitados

Fig. 3
Fig. 1
Fig. 3
Fig. 2

Otra de las pruebas que se utilizan es la cromatografía. Esta prueba sirve para identificar o purificar algun compuesto o elemento de una mezcla compleja de componentes. La que se ha usado en esta practica es la cromatografía en columna. En el laboratorio se hizo mediante intercambio iónico, ya que de esta manera se pueden separar proteínas en base a su carga iónica. Esto nos ayuda a separar Ig y poder cuantificarlas de acuerdo a la absorbancia (ABS) que se obtiene de cada una de las diluciones que se hacen de el material biológico a identificar o purificar.
La última prueba que se hizo, y que es muy imprtante, es la prueba de ELISA (Enzymed-Linked ImmunoSorbent Assay). Esta prueba se utiliza en la clínica para poder identificar si una persona tiene VIH o no. Puede ser directa o indirecta, la última fue la que se utilizó. En esta se coloca un muestra de suero que pueda contener anticuerpos (Ac) en un pozo con unos Agpredeterminados, si los Ac se unen a los Ag se detectan al agregar un complejo enzima-Ac que generalmente se unen a IgG. Si el Ac esta presente en el pozo el complejo enzima-Ac se unira a este. Después se pone el sustrato al cual la enzima se activa, si existe un cambio de color significa que este proceso se dio, si no cambia el color todo este proceso antes descrito no sucedió. En la Fig. 4 se puede observar en imagenes lo ya descrito.

Fig. 4. Método de ELISA Indirecto

Material y Método
Día 1
Primero se adquirió un conejo del bioterio y se aprendieron las técnicas de su manejo, como se realiza una extracción de una muestra de sangre de la oreja y como se realiza la administración intramuscular de suero. Se le tomó una muestra de sangre a un conejo por la arteria central de la oreja para poder usar 200 microlitros posteriormente. Luego se tomó una muestra de sangre a un integrante del equipo. Ambas muestras se metieron a centrifugar por 30 minutos a 2500 RPM para obtener sueros sanguíneos de cada uno. Se inoculó al conejo con el suero humano.
Días 15 y 30
Se tomó una muestra de sangre del conejo para así obtener el suero preinmunizado del mismo. Después se procedió a preparar el antígeno con suero humano y adyuvante de Freud's incompleto. Para esto se tomaron 200 microlitros del suero sin la aguja, después de eso se depositaron en un tubo de 1.5 ml y con una micropipeta se tomaron 100 microlitros de adyuvantede Freud's incompleto. Finalmente se le aplicó de forma subcutanea al conejo. Se realizó el mismo procedimiento 15 días después.
Día 55
Se tomó una muestra de sangre al conejo para obtener suero preinmunizado. Se preparó el antígeno esta vez utilizando el suero humano y Adyuvante de Freund´s completo. Después se le administró vía intramuscular al conejo.
Día 63
se tomó una muestra de sangre al conejo para obtener suero preinmunizado. Se preparó el antígeno utilizando el suero humano y sin el Adyuvante de Freund. Después se le administró vía intramuscular al conejo.
Posteriormente se realizó la Prueba de Ouchterlony. Con esta técnica se pueden
En un portaobjetos se extendió una película de gel de agarosa al 0.8%, una vez seco se le hicieron 6 pozos, donde 1 era rodeado por 5. En el centro se colocó el suero humano y en los pozos de alrededor se colocó el suero del conejo inmunizado. Con diferentes diluciones: 1:1. Se dejó en una camara húmeda por 48 hrs. Finalmente se observaron los resultados, si se formaron bandas de precipitación hasta el pozo dilución 1:8 se considera positiva. En un portaobjetos diferente se colocó de suero de rata en lugar de s uero del conejo inmunizado para ver las diferencias.
Cromatografía
La mas común es la cromatografía en columna.
Se coloca una matriz sólida luego la muestra que en este caso sería el suero obtenido de los conejos y luego elsolvente de tal forma que el solvente va ir saliendo gota a gota y después por goteo se obtiene fracciones que son de lo que se recupera de la columna y pueden ser proteínas.
Hay otra que es mas específica. Como las partículas de las proteínas son acidas son negativas, entonces si se ponen cargas positivas y por ley de cargas se van a unir. Para separarlas solamente se cambia el pH y se les salen las sustancias que tenían la carga neta.
La matriz que utilizaremos es amberlita y es una resina que tiene una carga neta positiva por lo que es catiónica. Se usa para la separación de inmunoglobulinas. Va a haber muestras enriquecidas con IgG.
ELISA
Se procedió a hacer una evaluación de IgG y sueros contra antígeno por ELISA indirecto.
Primero se sensibilizaron placas de 96 pozos utilizando una dilución 1/500 del suero humano, diluido en amortiguador de carbonatos 0.1 M pH 9.6 y se dejó incubando a 4°C toda la noche. Al día siguiente las placas se lavaron 3 veces por 5 minutos con 200ul de PBS al 0.05%. Se secaron y se guardaron a -20°C hasta la siguiente clase. Se descongelaron las placas dejandolas a temperatura ambiente. Se bloqueó por 30 minutos a 37ºC con 200 µl por pozo de una solución de leche descremada svelty al 5%. Se procedió a quitar esta solución de bloqueo y se repitieron los lavados. Se adicionaron los anticuerpos primarios, 5 a 10 µg/ml de IgG o las diluciones de sueros producto de lainmunización. Se incubaron 1 hora a 37ºC. Se lavó 4 veces con 200 µl, una vez con PBS-Tween al 0.05% y las siguientes tres con PBS. Se dejaron incubando los anticuerpos secundarios acoplados a HRP por 1 hora a 37ºC. Se realizaron mas lavados con PBS. Se adicionaran 100 µl/pozo del substrato, solución que contenga 4 µl de peróxido de hidrógeno (30%, w/v), 0.7 mg de Diaminobenzidina (DAB) y urea, disueltos en 10 ml de amortiguador PBS pH 7.4. Se incubó en oscuridad a temperatura ambiente y se agitó constantemente hasta que los controles negativos cambiaron ligeramente de color. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de placas de ELISA.
Conclusiones
El conjunto de pruebas realizadas para comprobar el funcionamiento y la eficiencia del sistema inmune del conejo fueron concluyentes para realizar ciertas afirmaciones. Primero, exite un sistema en los oraganismos que se encarga de “defender” al ser vivo de objetos o seres extraños, y este funciona apartir del contacto con las sustancias extrañas, para nuestro experimento se puede precisar el uso de suero humano y todas las sustancias extrañas para el conejo que funcionan como antigenos. Segundo, el sistema es progresivo, cambiante y parcialmente impredecible, especialmente la parte adaptativa del sistema inmune, como se ha estudiado, evoluciona, por lo que es posible detectar una reaccion mas eficiente contra los mismos antigenos cada vez que se enfrenta a el.Para comprobar la primer afirmacion se obtuvieron resultados positivos en las prubas de Outcherlony y en la cromatografia, en las pruebas previamente desarrolladas solo era posible una reaccion positiva si existian anticuerpos especigicos contra las proteinas humanas, con lo que se comprueba la existencia del sistema. Para la comprobacion de la segunda afirmacion se realizo la prueba de ELISA, la cual al mostrar una concentracion mayor de anticuerpos progresivante nos indicó que existe un incremento en la reaccion inmune contra un antigeno previamente conocido, con esto comprobando que existe un mecanismo (respuesta inmune adaptativa) que no solo reconoce a un antigeno si no que actua mas especificamente contra el mismo, creando una reaccion mas rapida y eficiente.
Es tambien importante concluir sobre la importancia tanto del uso correcto de los materiales y sustancias para obtener resultados positivos en las pruebas, ya que un error en el desarrollo de los experimentos es suficiente para alterar los resultados y por lo tanto las interpretaciones.
Bibliografía
* https://www.springerlink.com/content/v59h455130173350/fulltext.pdf
* https://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cromatografias.htm
* https://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/inmunologia/tema03/etexto03.htm
* https://pathmicro.med.sc.edu/mayer/IgStruct2000.htm
* https://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html