CULTIVO in vitro DEL AGUACATE

Se cultivaron embriones inmaduros y maduros de diferentes cultivares de aguacatero en el medio mineral de Murashige y Skoog (1962) a la mitad de su concentración, con la adición de 0.5 mg·litro-1 de BA (6-bencil aminopurina) en un caso y de 0.5 mg·litro-1 de BA y de GA3 (acido giberélico) en el otro. Los mejores resultados se obtuvieron en el medio que contenía GA3 donde se logró la formación de 3 a 10 brotes por embrión. El subcultivo en el mismo medio basal con 2.0 mg·litro-1 de AIB (acido indol-3-butírico) y 0.5% (p:v) de CA (carbón activado) provocó 30.0-40.0% de enraizamiento. El injerto de los brotes obtenidos in vitro en patrones previamente establecidos bajo condiciones de aislamiento fue también efectivo. Se obtuvieron plantas completamente conformadas cuando se extrajeron embriones maduros y se cultivaron en medio MS y DF (Dixon y Fuller, 1976) sin reguladores del crecimiento. La adición de CA (0.5%) garantizó un mejor crecimiento y un sistema radical bien conformado. Se lograron establecer microinjertos in vitro, utilizando como patrones las plantas obtenidas por cultivo de embriones. Se emplearon explantes nodales de plantas de vivero etioladas del cultivar ‘Duke-7’ para establecer la técnica de multiplicación in vitro. La emisión de brotes fue posible en el medio DF con 2.0 mg·litro- 1 de BA y de GA3, respectivamente, pero no huboformación de brotes múltiples en ninguna de las combinaciones de reguladores empleadas. Se logró el enraizamiento cuando al medio se incorporó 2.0 mg·litro-1 de AIB y 1.0 mg·litro-1 de GA3, así como con 5.0 mg·litro-1 de AIB y 1.0 mg·litro-1 de GA3, con porcentajes de éxito de 83.3 y 98.0%, respectivamente. La aclimatación de las plantas fue del 40.0%, y el crecimiento fue mas lento comparado con el de las provenientes de semillas en los viveros comerciales.

MATERIALES Y MÉTODOS
El material vegetal estuvo constituido por frutos maduros e inmaduros de diferentes cultivares de aguacatero procedentes de la colección, y por plantas jóvenes de semillas, e injertadas con los cultivares Suardía y Duke-7, que crecieron en invernaderos, bajo condiciones de humedad relativa y temperatura controladas.
A todos los medios de cultivo se le añadieron 30 g·litro-1 de sacarosa (excepto en el experimento donde se siguió la técnica de microinjerto de Gonzalez et al., 1977, donde se utilizó 75 g·litro-1), y el pH se ajustó a 5.7 ± 0 . Cuando se empleó medio sólido se agregaron 7 g·litro-1 de agar-agar.

Cultivo in vitro de embriones
* Se colectaron frutos pequeños (1.0-24.0 g) de diferentes cultivares de aguacatero. Se extrajeron los embriones adjunto a los cotiledones y se cultivaron en el medio de Murashige y Skoog (1962) diluido al 50% (MS½), líquido, suplementado con 0.5 mg·litro-1 de6-bencil aminopurina (BA), y con 0.5 mg·litro-1 de BA y 0.5 mg·litro-1 de acido giberélico (GA3), respectivamente.
A los 45 días de cultivo, los brotes se subcultivaron en el medio sólido de Murashige y Skoog (1962) (MS) con 2.0 mg·litro-1 de acido indol-3-butírico (AIB). Se consideró la adición o no de carbón activado al 0.5% (p:v). A los 45 días de cultivo se evaluó el número de brotes enraizados.
Ademas, se escindieron 10 brotes y se injertaron in vivo sobre patrones que crecieron bajo condiciones de aislamiento.
* Se tomaron semillas de frutos maduros y se sometieron al mismo método de desinfección superficial descrito anteriormente. Seguidamente se extrajeron los embriones con una porción pequeña de cotiledón y se cultivaron en los mismos medios de cultivo empleados para embriones inmaduros, pero en estado sólido. Después de 45 días, los brotes emitidos se subcultivaron en un medio MS con 2.0 mg·litro-1 de AIB y con la adición o no de CA al 0.5% (p:v).
RESULTADOS
Se detectó que el porcentaje de contaminación fue relativamente alto, debido fundamentalmente a la presencia de bacterias en los frutos colectados.
Se observó que el porcentaje de embriones establecidos es bajo, si se toma en consideración el total cultivado in vitro; sin embargo, los que se mantuvieron latentes, y donde sólo se observó un engrosamiento de los cotiledones, son reducidos.
Microinjertos in vitroLos microinjertos se realizaron según la metodología descrita por Gonzalez et al. (1977) empleada para cítricos, que consiste en un corte en forma de ventana triangular en el extremo del patrón decapitado, donde se implantó el apice. Las plantas microinjertadas se cultivaron en medio MS líquido con las vitaminas de White y 75 mg·litro-1 de sacarosa.
Patrones de ‘Duke-7’ obtenidos por la misma vía, se microinjertaron utilizando la técnica sugerida por Pliego-Alfaro et al. (1986), con yemas axilares provenientes de plantas jóvenes injertadas del cultivar Suardía. La misma consistió en el aislamiento de la yema practicando un corte en forma de cuña en el vastago previamente desinfectado, la cual se situó en una incisión vertical practicada en el extremo del patrón decapitado. Se utilizó medio MS sólido con 1.0 mg·litro-1 de BA.
RESULTADOS
De los microinjertos realizados por el método de Gonzalez et al. (1977), prendieron el 20.0 % cuando se utilizaron patrones sin etiolar, y crecieron sólo el 11.4%. La aclimatación de las plantas microinjertadas fue baja. El empleo de patrones etiolados fue totalmente inefectivo.
Cuando se empleó la técnica sugerida por Pliego-Alfaro et al. (1986) el prendimiento de los microinjertos fue sólo del 5.0 %. Se produjo oxidación de los tejidos tanto en las yemas como en el corte realizado al patrón.

Multiplicación in vitro
Se empleó como materialvegetal plantas procedentes de semillas e injertadas de ‘Duke’, las cuales, después de podadas se colocaron en una camara oscura para inducir la emisión de brotes etiolados.
Posteriormente se asperjaron con fungicidas de contacto y sistémicos de forma alternada a intervalos semanales. A partir de los 30-45 días se tomaron secciones de ramas y se practicó una desinfección superficial.

Para el establecimiento in vitro se emplearon apices caulinares (1.0 cm) y explantes nodales (0.6 cm) y se cultivaron en los medios MSM (Schall, 1987) y DF (Dixon y Fuller, 1976) suplementados con 2.0 mg·litro-1 de BA (6-bencil aminopurina) y con 2.0 mg·litro-1 de GA3 (acido giberélico), respectivamente. A los 45 días de cultivo se determinaron el porcentaje de brotación y la longitud de los brotes (cm).
Brotes de aproximadamente 1.0 cm se subcultivaron en MSM y DF suplementados con 2.0 y con 5.0 mg·litro-1 de BA.
Los brotes se clasificaron en dos categorías de acuerdo a su tamaño: (0.5-1.0 cm) y (1.1-2.0 cm) y se determinaron los porcentajes en cada caso.

Para el enraizamiento in vitro se empleó el medio basal DF suplementado con 2.0 mg·litro-1 de AIB (acido indol-3-butírico); 2.0 mg·litro-1 de AIB + 1.0 mg·litro-1 de GA3; 5.0 mg·litro-1 de AIB y 5.0 mg·litro-1 de AIB + 1.0 mg·litro-1 de GA3. En todos los casos se adicionó CA al 0.5% (p:v). A los 60 días se determinó el porcentaje debrotes enraizados.
RESULTADOS

Multiplicación in vitro
Plantas procedentes de semillas
En casi todos los tratamientos no se detectaron la formación de brotes múltiples, solamente cuando al medio DF se adicionó 2.0 mg·litro-1 de BA se obtuvieron 2 brotes de forma eventual. Cuando se incorporaron la L-arginina y la L-glutamina a razón de 40 mg·litro-1 se vio favorecido el desarrollo de la lamina foliar.

DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en este caso, coinciden con los de Skene y Barlass (1983) y Rodríguez et al. (1993, 1995), ya que se obtienen brotes múltiples con la adición de BA al medio de cultivo. Se comprobó que el GA3 provoca ademas un efecto positivo en los primeros estadíos del desarrollo de los mismos, resultados que coinciden con los de Nel y Kotze (1982).
Dos de los inconvenientes de esta técnica son la alta tasa de contaminación por bacterias que presentan los frutos pequeños que se desprenden de los arboles, y el hecho de que los frutos de dimensiones muy pequeñas no responden a ella.
El cultivo in vitro de embriones maduros se ha empleado para la selección de genotipos resistentes a la salinidad (Gonzalez-Rosas et al., 1991b), y para el rejuvenecimiento de cultivares como paso previo a la micropropagación (Pliego-Alfaro et al., 1986; Pliego y Murashige, 1987). La obtención de patrones bien conformados se logró preferentemente en el medio DF sin suplemento dereguladores del crecimiento y la adición de carbón activado al 0.5%. Los microinjertos realizados, siguiendo las técnicas de Gonzalez et al. (1977) y de Pliego-Alfaro et al. (1986), tuvieron bajos prendimientos, debido posiblemente a problemas de manipulación y a la oxidación de los tejidos.
La inducción de brotes durante el establecimiento in vitro fue superior cuando se adicionó BA y GA 3 a cada medio basal.
Practicamente no se detectó la formación de brotes múltiples en casi ninguno de los medios empleados.
Una de las dificultades fundamentales que tiene la micropropagación de especies leñosas es la inducción del enraizamiento. Los porcentajes de éxito fueron superiores cuando se partió de material vegetal obtenido de semillas y al medio DF se le adicionó BA y GA 3. En material adulto, la exposición de brotes en medio salino MS a la tercera parte de su concentración original con 25.0 mg·litro-1 de AIB durante tres días y el subcultivo al mismo medio basal sin reguladores permitió un 30.0- 40.0 % de enraizamiento en los portainjertos ‘GA-13’ y ‘IV-8’ cuando el material vegetal se rejuveneció a través del microinjerto y sólo de 0 - 5.0 % si no se empleaba esta técnica (Barceló-Muñoz et al., 1988; Pliego- Alfaro et al., 1990). Barceló-Muñoz et al. (1995) lograron 40.0- 50.0 % en el patrón ‘RR- 86’ y lo incrementaron a 70.0- 80.0 % si permanecían tres días a la oscuridad.