PREPARACION DE MEDIOS Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO

Fundamento: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparación de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizadosen el autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales. 5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos. 6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos. 7. Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio. 8. Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.

9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos. Tipos de medios de cultivo. Por suCONSISTENCIA: a) Sólidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada). b) Líquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers. Por su COMPOSICIÓN: a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos. b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee. Siembra de microorganismos En términos microbiológicos se entiende por SIEMBRA el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento. PARA UNA CORRECTA REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA SON NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES: 1) Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista microbiológico.


•La esterilización Se utilizan dos tipos principales de esterilización: Por MÉTODOS FÍSICOS (calor, filtración, radiaciones). Por MÉTODOS QUÍMICOS (empleo de soluciones químicas). Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso del calor húmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presión y la temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullición del agua. Normalmente, se lleva la presión a 1 atmósfera (por encima de la ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126sC, manteniéndolo en estas condiciones durante 20 minutos. Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc se esteriliza con calor seco, siendo el 'horno Pasteur' el aparato más empleado (se somete a temperaturas de 140-180 sC durante 2h-3h). En el caso de objetos metálicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el momento de su utilización, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la precaución de enfriarlos antes de su uso. 2) Que el inóculo no se contamine, modifique o destruya: Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente. 3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Esto se resuelve con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no sedispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente.

Material de la Práctica: Mechero bunsen o similar Asa de siembra Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus. Material a preparar por el alumno: 1 Tubo con medio líquido estéril (caldo común): Luria Bertani (LB) 2 Tubos con medio sólido estéril (agar inclinado): TSI Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud. Métodos: 1s) PREPARACIÓN DE MEDIOS • Preparación de un medio sólido en placa.

1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos añadirlo a una concentración de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella. 2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca. 3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella en un baño a 40sC al menos durante 30 minutos. 4. Distribuir el medio en las placas de Petri que están estériles dentro de una campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones. 5. Dejar que el medio solidifique. • Preparación de medio sólido en tubo (slant). 1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un matraz. 2. Fundir elmedio en un horno microondas o en una placa caliente. El medio debe hervir hasta que se vuelva transparente. 3. Distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que comience a solidificar. Para ello se empleará una pipeta y los tubos no se llenarán más de un tercio de su volumen. 4. Autoclavar. 5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener tubos con medio en slant. • Preparación de medio líquido en tubo (caldo).

1. Pesar y rehidratar el medio. 2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos más de 1/3 de su volumen). 3. Autoclavar. 4. Sacar del autoclave y dejar enfriar. Todos los medios se guardan en nevera a 4sC. 2s) REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA 1 Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo. Realizar la siembra, como sigue: a) Siembra en medio líquido: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo que se lleva al tubo estéril con medio líquido (agitándola en el seno del medio), tomando las precauciones mencionadas anteriormente. b) Siembra en placa: Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inóculo tomado de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inóculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente por su superficie en zig-zag. c) Siembra en agar inclinado: Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inóculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizandoel asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis). 3s) INCUBACIÓN de los medios sembrados a 37 sC hasta que haya habido crecimiento bacteriano. 4s) OBSERVACIÓN DE LOS RESULTADOS: En primer lugar, observar a simple vista diversas características como el color y el borde de las colonias crecidas en el agar así como el olor y la turbidez del medio ya que en algunos casos suelen ser típicos de un determinado tipo de microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificación.

El siguiente paso sería la observación al microscopio, que será objeto de otra práctica.