FOSFORILACION OXIDATIVA

La fosforilación oxidativa es un proceso metabólico que utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes para producir adenosín trifosfato (ATP). Se le llama así para distinguirla de otras rutas que producen ATP con menor rendimiento, llamadas 'a nivel de sustrato'. Se calcula que hasta el 90% de la energía celular en forma de ATP es producida de esta forma.
Consta de dos etapas: en la primera, la energía libre generada mediante reacciones químicas redox en varios complejos multiproteicos -conocidos en su conjunto comocadena de transporte de electrones- se emplea para producir, por diversos procedimientos como bombeo, ciclos quinona/quinol o bucles redox, un gradiente electroquímico de protones a través de una membrana asociada en un proceso llamado quimiosmosis. La cadena respiratoria esta formada por tres complejos de proteínas principales (complejo I,III, IV), y varios complejos 'auxiliares', utilizando una variedad de donantes y aceptores de electrones. Los tres complejos se asocian en supercomplejos para canalizar las moléculas transportadoras de electrones, lacoenzima Q y el citocromo c, haciendo mas eficiente el proceso.

La energía potencial de ese gradiente, llamada fuerza protón-motriz, se libera cuando se translocan los protones a través de un canal pasivo, la enzima ATP sintasa, y se utiliza en la adición de un grupo fosfato a una molécula de ADP para almacenar parte de esa energía potencial en los enlaces anhidro 'de alta energía' de lamolécula de ATP mediante un mecanismo en el que interviene la rotación de una parte de la enzima a medida que fluyen los protones a través de ella. En vertebrados, y posiblemente en todo el reino animal, se genera un ATP por cada 2 protones translocados. Algunos organismos tienen ATPasas con un rendimiento menor.
Existen también proteínas desacopladoras que permiten controlar el flujo de protones y generar calor desacoplando ambas fases de la fosforilación oxidativa.
Aunque las diversas formas de vida utilizan una gran variedad de nutrientes, casi todas realizan la fosforilación oxidativa para producir ATP, la molécula que provee de energía al metabolismo. Esta ruta es tan ubicua debido a que es una forma altamente eficaz de liberación de energía, en comparación con los procesos alternativos de fermentación, como la glucólisis anaeróbica.
Pese a que la fosforilación oxidativa es una parte vital del metabolismo, produce una pequeña proporción de especies reactivas del oxígeno tales como superóxido yperóxido de hidrógeno, lo que lleva a la propagación de radicales libres, provocando daño celular, contribuyendo a enfermedades y, posiblemente, al envejecimiento. Sin embargo, los radicales tienen un importante papel en la señalización celular, y posiblemente en la formación de enlaces disulfuro de las propias proteínas de la membrana interna mitocondrial. Las enzimas que llevan a cabo esta ruta metabólica son blanco de muchas drogas y productos tóxicos que inhiben su actividad.

CADENA DETRANSFERENCIA DE ELECTRONES
La cadena de transporte de electrones transporta tanto protones como electrones, transfiriendo electrones desde donantes hacia aceptores, y transportando protones a través de la membrana. Estos procesos utilizan moléculas de transferencia tanto solubles como unidas a proteínas. En la mitocondria, los electrones son transferidos dentro del espacio intermembranal por la proteína de transferencia de electrones solubles en agua, citocromo c. Esto transporta solamente electrones, y estos son transferidos por la reducción y oxidación de un atomo de hierro que se encuentre en el grupo hemo de la proteína. El citocromo c se encuentra también en algunas bacterias, donde se ubica en el espacio periplasmatico.
Dentro de la membrana interna mitocondrial, el transportador de electrones liposoluble, lacoenzima Q10 (Q) transporta tanto electrones como protones a través de un ciclo redox. Esta pequeña molécula de benzoquinona es muy hidrófobica, de modo que difunde libremente en la membrana. Cuando Q acepta dos electrones o libera dos protones, es reducida a su forma ubiquinol (QH2); cuando QH2 libera dos electrones o acepta dos protones, es oxidada a su forma original de ubiquinona (Q). Como resultado, si dos enzimas estan organizadas de modo que Q es reducida de un lado de la membrana y QH2 oxidada en el otro, la ubiquinona se acoplara a estas reacciones y actuara como lanzadera de protones a través de la membrana. Algunas cadenas de transporte de electrones bacterianas utilizanquinonas diferentes, como la menaquinona, aparte de la ubiquinona.
Dentro de las proteínas, los electrones son transferidos entre cofactores de flavina, centros hierro-azufre, y citocromos. Existen varios tipos de centros hierro-azufre; los mas simples que se encuentran en la cadena de transferencia de electrones consisten en dos atomos de hierro unidos por dos atomos azufre inorganico; estos son centros [2Fe–2S]. El segundo tipo, los centros [4Fe–4S], contienen un cubo de cuatro atomos de hierro y cuatro de azufre. Cada atomo de hierro en estos centros es coordinado por un aminoacido, generalmente por el atomo de azufre de la cisteína. Los iones metalicos cofactores atraviesan por reacciones redox sin unir o liberar protones, de modo que en la cadena de transporte de electrones sirven solamente para el transporte de electrones entre proteínas. Los electrones se desplazan largas distancias a través de las proteínas saltando entre las cadenas que forman estos cofactores. Esto ocurre por efecto túnel, el cual es rapido sobre distancias menores a 1 −9 m.

SISTEMA MITOCONDRIAL

En el proceso citoplasmico de la glucólisis se produce NADH. Estos equivalentes reductores deben poder entrar a la mitocondria para ser utilizados en la cadena de transporte de electrones para su oxidación aerobica. Así mismo, los metabolitos mitocondriales como el oxaloacetato y acetil-CoA, precursores de la biosíntesis mitocondrial de glucosa y acidos grasos respectivamente, deben poder abandonar la mitocondria.En la mitocondria, se produce una enorme cantidad de energía en forma de ATP, después de la ocurrencia de la fosforilación oxidativa, esta importante molécula energética, debe abandonar la mitocondria para poder intervenir en múltiples reacciones citoplasmicas.

El ATP generado en la fosforilación oxidativa a partir de ADP y Pi se utiliza en el citoplasma; el Pi así formado, retorna al interior mitocondrial vía un simportador Pi-H+ alimentado por el componente D pH del gradiente electroquímico de protones. Entonces el gradiente del potencial electroquímico generado por el bombeo redox de protones del transporte electrónico, es el responsable de mantener los altos niveles mitocondriales de ADP y Pi, ademas de proveer de la energía libre para sintetizar ATP.

INHIBIDORES

Existen varias drogas y toxinas que inhiben la fosforilación oxidativa. Aunque estas toxinas inhiben sólo una enzima en la cadena de transporte de electrones, la inhibición de cualquier paso detiene el resto del proceso. Por ejemplo, cuando la oligomicina inhibe a la enzima ATP sintasa, los protones no pueden ser devueltos a la mitocondria. Como resultado, las bombas de protones son incapaces de operar, y el gradiente se torna demasiado fuerte como para ser superado. NADH deja de ser oxidado y el ciclo del acido cítrico deja de operar porque la concentración de NAD+ cae por debajo de la concentración que estas enzimas pueden utilizar.
Cianuro: El cianuro es un potente veneno que inhibe la cadena de transporte deelectrones y la fosforilación oxidativa bloqueando el paso de electrones del citocromo a3 al oxígeno en el complejo IV. Esto bloquea la cadena de transporte de electrones, lo que conlleva que no se genere el gradiente de protones y por tanto no se produzca la obtención de ATP con la consiguiente acumulación de NADH y FADH2. Ademas el cianuro se une a la hemoglobina impidiendo también la captación de oxígeno.
Oligomicina: La oligomicina, un antibiótico producido por Streptomyces, inhibe a la ATPasa al unirse a la subunidad Fo e interferir en el transporte de H+ a través de Fo, inhibe por lo tanto la síntesis de ATP y como consecuencia de no eliminar el gradiente de protones se inhibe también a la cadena de transporte de electrones. por lo tanto disminuira el consumo de O2 y se acumulara NADH y FADH2.
2 -Dinitrofenol: El 2,4-dinitrofenol es un agente desacoplante, es decir, desacopla la cadena de transporte de electrones de la fosforilación oxidativa. El desacoplamiento se produce ya que el 2 -dinitrofenol hace permeable a los protones la membrana interna mitocondrial deshaciendo la relación obligada entre la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa. El efecto de este veneno por tanto es la inhibición de la producción de ATP al no generarse el gradiente de pH pero si permite que la cadena de transporte de electrones continúe funcionando.

Compuesto Uso Efecto en la fosforilación oxidativa
Cianuro y
monóxido de carbono
Veneno Inhiben la cadena de transporte de electrones ya que seunen mas fuertemente que el oxígeno a los centros Fe–Cu en la citocromo c oxidasa, y por tanto evitan la reducción del oxígeno.
Oligomicina
Antibiótico
Inhibe la ATP sintasa bloqueando el flujo de protones a través de la subunidad Fo.
CCCP
2 -Dinitrofenol
Veneno Ionóforos que interrumpen el gradiente de protones transportando estos a través de la membrana. Este ionoforo desacopla el bombeo de electrones de la ATP sintasa debido a que transporta electrones a través de la membrana mitocondrial interna.
Rotenona
Pesticida
Impide la transferencia de electrones del complejo I a la ubiquinona al bloquear los sitios de unión a la ubiquinona.
Malonato yoxaloacetato
Inhibidores competitivos de la succinato de hidrogenasa (complejo II).
No todos los inhibidores de la fosforilación oxidativa son toxinas. En el tejido adiposo marrón, los canales de protones regulados llamados proteínas desacopladoras son capaces de desacoplar la respiración de la síntesis de ATP. Esta respiración rapida produce calor, y es particularmente importante como una vía para mantener la temperatura corporal en la hibernación de los animales, aunque estas proteínas pueden también tener una función mas general en la respuesta de las células al estrés oxidativo.

LA TEORIA QUIMIOSMOTICA
Peter Mitchell propuso la 'hipótesis quimiosmótica en 1961. La teoría sugiere esencialmente que la mayor parte de la síntesis de ATP en la respiración celular, viene de un gradiente electroquímico existente entre lamembrana interna y el espacio intermembrana de la mitocondria, mediante el uso de la energía de NADH y FADH2 que se han formado por la ruptura de moléculas ricas en energía, como la glucosa.

Las moléculas como la glucosa, son metabolizadas para producir Acetil-CoA como un intermediario rico en energía. La oxidación de Acetil-CoA en la matriz mitocondrial esta acoplada a la reducción de una molécula transportadora como NAD+ y FAD.

Los transportadores traspasan electrones a la cadena transportadora de electrones en la membrana mitocondrial interna, que luego los traspasan a otras proteínas en la cadena transportadora. La energía disponible en los electrones se usa para bombear protones desde la matriz, a través de la membrana mitocondrial interna, guardando energía en forma de un gradiente electroquímico transmembrana. Los protones se devuelven a través de la membrana interna, mediante la enzima ATP-sintasa. El flujo de protones de vuelta a la matriz mitocondrial mediante la ATP-sintasa, provee de suficiente energía para que el ADP se combine con Fósforo inorganico para formar ATP. Los electrones y protones en la última bomba proteica de la cadena transportadora son llevados alOxígeno (O2) para formar Agua (H2O).

Ésta fue una propuesta radical en su tiempo, y no fue bien aceptada. La visión que prevalecía era que la energía de la transferencia electrónica se almacenaba es un intermediario estable de alta energía, un concepto mas conservativo del punto de vista químico. EL problema de ésteviejo paradigma fue que nunca se encontró aquel intermediario, y la evidencia del bombeo de protones por los complejos de la Cadena de Transporte de electrones creció de forma tal, que no pudo ser ignorada. Eventualmente, el peso de la evidencia comenzó a favorecer la hipótesis quimiosmótica, y en 1978, el Premio Nobel de química fue entregado a Peter Mitchell.

El acoplamiento quimiosmótico es importante en la producción de ATP en el cloroplasto y muchos tipos de bacteria.

ATP SINTASAS
ATP sintasa, también llamada complejo V, es la enzima final del proceso de la fosforilación oxidativa. Esta enzima se encuentra en todas las formas de vida y funciona de la misma manera tanto en procariotas como en eucariotas. Esta enzima usa la energía almacenada en un gradiente de protones a través de la membrana para llevar a cabo la síntesis de ATP desde ADP y fosfato (Pi). Las estimaciones del número de protones necesarios para sintetizar una molécula de ATP oscilan entre tres y cuatro, y algunos investigadores sugieren que las células pueden variar esta proporción, para ajustarse a diferentes condiciones.

Esta reacción de fosforilación es un equilibrio, que puede ser cambiado alterando la fuerza protón motriz. En ausencia de una fuerza protón motriz, la reacción de la ATP sintasa se desplazara hacia la izquierda, hidrolizando ATP y bombeando protones fuera de la matriz a través de la membrana. Sin embargo, cuando la fuerza protón motriz es alta, la reacción es forzada a desplazarse en ladirección opuesta; de izquierda a derecha, permitiendo el flujo de protones en el sentido de su gradiente de concentración produciendo ADP desde ATP. Es mas, en la cercanamente relacionada proteína H+-ATPasa tipo vacuolar, la misma reacción es usada para acidificar los compartimentos celulares, bombeando protones e hidrolizando ATP.
La ATP sintasa es un complejo masivo de proteínas con forma de hongo. El complejo de enzimas en mamíferos contiene 16 subunidades y posee una masa de aproximadamente 600 kilodaltons. La porción embebida en la membrana es llamada FO y contiene un anillo de subunidades c y el canal de protones. El pedúnculo y la parte superior esférica es llamada F1 y es el sitio donde ocurre la síntesis de ATP. La porción esférica del extremo de F1 contiene seis proteínas de dos tipos diferentes (tres subunidades α y tres subunidades β), mientras que el 'pedúnculo' consiste solo en una proteína: la subunidad γ, con un extremo extendiéndose en la esfera de subunidades α y β. Ambas subunidades, α y β se unen a nucleótidos, pero solo la subunidad β cataliza la síntesis de ATP. Alcanzando por la base una porción de F1 e introduciéndose en la membrana se encuentra una larga subunidad en forma de bastón que ancla las subunidades α y β en la base de la enzima.
A medida que los protones atraviesan la membrana a través del canal en la base de la ATP sintasa, FO entra en rotación. Esta rotación puede ser provocada por cambios en la ionización de aminoacidos en el anillo de subunidades cprovocando interacciones electrostaticasque impulsan el anillo de subunidades c a través del canal de protones. Este anillo de rotación provoca la rotación del eje central (el pedúnculo de la subunidad γ) dentro de las subunidades α y β. Estas subunidades son incapaces de rotar debido al brazo lateral que actúa como un estator. Este movimiento del extremo de la subunidad γ en el interior de la esfera de subunidades α y β provee de energía para los sitios activos en las subunidades β para llevar a cabo un ciclo de movimientos que generan y luego liberan ATP.
La reacción de síntesis de ATP es llamada 'mecanismo de cambio de unión' del inglés binding change mechanism e involucra el sitio activo de una subunidad β en ciclando a través de tres estados. En el estado 'abierto', el ADP y el fosfato entran en el sitio activo (mostrado en marrón en el diagrama). La proteína luego captura las moléculas y se une a ellas ligeramente (mostrado en rojo). La enzima luego cambia su conformación nuevamente y acerca las moléculas, con el sitio activo en el estado final (mostrado en rosado) uniendo el recién formada molécula de ATP con una elevada afinidad. Finalmente, el sitio activo cicla de nuevo a su estado original abierto, liberando ATP y uniéndose a mas ADP y fosfato, preparandose así para el próximo ciclo.
En algunas bacterias y arqueas, la síntesis de ATP es llevada a cabo por el movimiento de iones sodio a través de la membrana celular, en lugar del movimiento de protones. Arqueas tales comoMethanococcus poseen la sintasa A1Ao, una forma de la enzima que contiene proteínas adicionales con muy poca similaridad en cuanto a su secuencia con otras subunidades de ATP sintasa de bacterias o eucariotas. Es posible que en algunas especies, la forma A1Ao de la enzima sea una ATP sintasa especializada en el transporte de sodio, pero esto puede que no sea así en todos los casos.

ESTRÉS OXIDATIVO
El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción deespecies reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rapidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. Todas las formas de vida mantienen un entorno reductor dentro de sus células. Este entorno reductor es preservado por las enzimas que mantienen el estado reducido a través de un constante aporte de energía metabólica. Desbalances en este estado normal redox pueden causar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libresque dañan a todos los componentes de la célula, incluyendo las proteínas, los lípidos y el ADN.
En el ser humano, el estrés oxidativo esta involucrado en muchas enfermedades, como la aterosclerosis, la enfermedad de Parkinson,encefalopatía mialgica, sensibilidad química múltiple, y la enfermedad de Alzheimer y también puede ser importante en el envejecimiento. Sin embargo, las especies reactivas de oxígeno pueden resultar beneficiosas ya que son utilizadas por el sistema inmunitario como un medio para atacar y matar a los patógenos. Lasespecies reactivas del oxígeno son también utilizadas en la señalización celular. Esta es denominada señalización redox.

ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO (ERO
Las especies reactivas del oxígeno (ERO o ROS por reactive oxygen species) incluyen iones de oxígeno, radicales libres y peróxidostanto inorganicos como organicos. Son generalmente moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a la presencia de una capa deelectrones de valencia no apareada. Estas especies se forman de manera natural como subproducto del metabolismo normal del oxígeno y tienen un importante papel en la señalización celular. Sin embargo, en épocas de estrés ambiental sus niveles pueden aumentar en gran manera, lo cual puede resultar en daños significativos a las estructuras celulares. Esto lleva en una situación conocida como estrés oxidativo.
Normalmente las células son capaces de defenderse a sí mismas contra los daños de las especies reactivas del oxígeno mediante el uso deenzimas como la superóxido dismutasa y la catalasa. Pequeñas moléculas antioxidantes como el acido ascórbico (vitamina C), acido úrico, y glutatión también desempeñan un rol importante como antioxidantes celulares. Del mismo modo, los polifenoles antioxidantes colaboran en la prevención de los daños causados por las especies reactivas del oxígeno eliminando radicales libres. Por el contrario, la capacidad antioxidante del espacio extracelular es relativamente poca e.g. el mas importante antioxidante en el plasma humano es el acido úrico.
Losefectos de las especies reactivas del oxígeno sobre el metabolismo celular han sido bien documentadas en una gran variedad de especies. Estos incluyen no sólo los roles en la muerte celular programada y la necrosis, sino también efectos positivos, tales como la inducción de genes de defensa y la movilización de los sistemas de transporte de iones. También se lo implica con frecuencia en funciones de señalización redox o señalización oxidativa. En particular, las plaquetas que participan en la reparación de heridas y homeostasis de la sangre liberan especies reactivas del oxígeno para reclutar mas plaquetas en los sitios de lesión. Estas también proporcionan un enlace a la adaptación del sistema inmune a través del reclutamiento de glóbulos blancos.
Las especies reactivas del oxígeno estan implicadas en la actividad celular a una variedad de respuestas inflamatorias incluyendo las enfermedades cardiovasculares. También pueden estar involucradas en el daño cóclear inducido por elevados niveles de sonido, ototoxicidad de drogas como el cisplatino y en la sordera congénita en animales y humanos. La señalización redox también esta implicada en la mediación de la apoptosis o muerte celular programada y en la lesión isquémica. Ejemplos concretos son los accidentes cerebrovascularesy ataques cardíacos.
En general, los efectos nocivos de las especies reactivas del oxígeno en la célula son
Daños al ADN
Oxidación de acidos grasos poliinsaturados
Oxidación de aminoacidos en las proteínas