INTRODUCCIÓN:
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor sera la probabilidad de estar frente a unacontaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como indicadores de malas practicas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con habitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra.

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso maximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,
Citrobacter y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, esta constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la mas prominente es Escherichia coli.


La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número mas Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de acido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lactosado el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentesen la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número mas probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h.

La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar EMB) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas basicas (IMViC) a las colonias típicas.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La causa mas común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorragica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne.

JUSTIFICACIÓN
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.

OBJETIVO GENERAL:

Aplicar la técnica del Numero Mas Probable con el fin de establecer un lineamiento de calidad en alimentos.



OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de aguao alimentos mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Organizar e interpretar los resultados.

Aplicar la técnica del Numero Mas Probable con el fin de establecer un lineamiento de calidad en alimentos.

MARCO TEÓRICO
El método del Número mas probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés), también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de población que se emplea cuando una evaluación cuantitativa de elementos individuales no es factible. l método se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o negativo) de atributos específicos de microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u otros ambientes. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o mas células microbianas procedentes de la muestra, se pondran turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permaneceran transparentes.
Al aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contendran tan sólo un microorganismo y otros tubos no contendran ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no hayanrecibido ninguna célula, se puede estimar el número mas probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir de una tabla estadística.1
La precisión del método del número mas probable aumenta con el número de tubos que se usan; cinco tubos por dilución se considera como una relación adecuada entre precisión y economía.
Una condición del método es la necesidad de poder reconocer un atributo específico de la población en el medio de crecimiento que se emplee. La estimación de la densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el empleo del calculo probabilístico.2
Hay muchas entidades discretas que son faciles de detectar pero difíciles de contar. Una aplicación es el de cualquier clase de reacción de amplificación o reacción de catalisisque impide una cuantificación facil, pero permite que su presencia sea detectada de modo muy sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de microoganismos, acción enzimatica, o catalisis química. El método del NMP supone tomar la disolución original o muestra y subdividirla en un factor (frecuentemente 10 veces,o 2 veces) y evaluar la presencia/ausencia en múltiples subdivisiones.
El grado de dilución para el cual comienza a aparecer la ausencia indica que los elementos se han diluido tanto que hay muchas submuestras en las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier concentración dada permite una resolución mas fina, para usar el número de muestras positivas y negativas que estiman la concentración original dentro del apropiado orden de magnitud.





MATERIAL Y REACTIVO
Matraces Erlenmeyer
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 10 ml
Tubos de ensayo de 15 x 100
Campanasde Durham
Tubos de ensayo de 13 x 100
Cajas de Petri
Portaobjetos
Asas de punta y siembra
Mechero
Incubadora

Reactivos

Caldo lactosado
Peptona
Caldo bilis verde brillante al 2%
Agar EMB
Agar SIM
Citrato de Simmons
Urea
TSI
muestra
ENCHILADAS VERDES
Procedimiento

Día 1. Preparación de la muestra y Prueba presuntiva.

1.- Preparar caldo lactosado suficiente para 10 tubos de ensayo con campana de Durham.
2.- Preparar una solución de agua peptonada al 0.1 %.
3.- Esterilizar los medios preparados.
4.- Moler 10.0 gramos de la muestra en la licuadora mezclar.
5.- Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3 minutos.
5.- Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %.
6.- Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lactosado.

7.- Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lactosado. Tres tubos restantes serviran de testigo.
Incubar a 35-37°C durante 24-48 h. De acuerdo al código se procedera a la prueba


Día 2. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales y fecales.

1.- Preparar caldo bilis verde brillante suficiente para 20 tubos de ensayo con campana de Durham.
2.- Esterilizar los medios preparados.
3.- Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro tubo de 15 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
4.- Agitar los tubos para su homogeneización.
5.- Incubar los tubos con caldo bilis verde brillante a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h.
6.- Incubar los tubos con a baño maria conajitacion a 44.5 ± 0.1°C en incubadora durante 24 a 48 h.


Día 3. Prueba confirmatoria para aislamiento de Escherichia coli.

1.- Preparar agar EMB suficiente para 2 cajas de Petri, y esterilizar.
2.- Vaciar en las placas una placas seran para coliformes fecales y un testigo, otra placas seran para coliformes totales. Esperar a que solidifique.
3.- Con el asa de siembra, realizar la técnica de estría cruzada en la superficie del agar solidificado.
4.- Invertir las placas e incubar a 35 ± 2°C durante 24 h.



4.-Después del tiempo de incubación, observar resultados y seguir individualmente cada inoculación
5.- Para la prueba de indol (I), añadir gotas de reactivo de Kovacs a los tubos de ensayo con medio SIM y observar las reacciones (S, producción de H2S; I, producción de indol; M, movilidad).
6.- Para la prueba de citrato (C), observar las coloraciones del inoculo.

RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Resultados de la prueba presuntiva en caldo lactosado.


En los 9 tubos inoculados se desarrollaron los microorganismos. Por lo tanto el código es:


Tubos con caldo bilis verde brillante inoculados.

En los tubos que se colocaron en la incubadora fueron todos positivos Tubos (E.coli totales)
El código fue: 3/3 ,3/3 ,3/3 = (3, 3,3)
En los tubos que se colocaron en el baño maría Tubos (E.coli fecales)
El código fue: 3/3 ,3/3 ,3/3 = (3, 3,3)

Tablas de los números mas probables:

E.coli totales
10x-1(1.10)
10x-2 (1.100)
10x-3 (1.1000)
1
3/3
3/3
3/3
2
3/3
3/3
3/3
3
3/3
3/3
3/3
Código:3,3,3
MPN:



E.coli fecales
10x-2
10x-2
10x-3
1
3/3
3/3
3/3
2
3/3
3/3
3/3
3
3/3
3/3
3/3
Código:3,3,3MNP:











Cajas de Petri conteniendo colonias inoculadas de tubos con caldo bilis verde brillante.


Observamos colonias con brillo metalico en las placas de diluciones 10-2 y 10-2.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Indol
Resultado: negativa (-)
Se empleo el medio SIM, el cual nos ofrece motilidad, producción de indol, y producción de acido sulfhídrico






Citrato de Simmons
resultado: POSITIVA (+)

El citrato de Simmons nos indica si el citrato es empleado como única fuente de carbono para las bacterias.

medio TSI
resultado: positivo (+)

Observamos la producción del gas en estos medios




CALDO UREA
RESULTADO: NEGATIVO (-)
No obtuvimos cambión en este medio no obtuvimos turbidez

CONCLUSIONES:
Al realizar todas las pruebas, podemos obtener de las fuentes de información de los distintos medios, las características del crecimiento de Escherichia coli.

Caldo lactosado. Crecimiento bueno, producción de gas positivo.
Caldo bilis verde brillante. Crecimiento bueno, producción de gas positivo.
Agar EMB. Tipo de colonia: verdosas con brillo metalico y centro negro azulado.

En el cuadro mostramos los resultados de las pruebas bioquímicas:

En este caso en las pruebas bioquímicas debido a la reacciones IMviC se pudo comprobar la existencia de la enterobacter.
PRUEBAS
E.COLI
ENTEROBACTER
SIM
(-)
(+)
CITRATO
(-)
(+)
TSI
(+)
(+)
UREA
(-)
(-)



BIBLIOGRAFIA:
https://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-Ecoli-NMP_6529.pdf

https://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/