Curva de crecimiento bacteriano
y como la temperatura influencia
en la clasificación de bacterias
Tairis Aponte Santiago- Doriliz Martell Ruiz-
Dayra Nazario Torres- Jaleidy Z. Hernández González
Biol 3770-066L
Universidad de Puerto Rico
Recinto Universitario de Mayaguez
Abstract: Entender la dinámica de crecimiento en un cultivo de una bacteria,
identificar las fases típicas de una curva de crecimiento y entender la
relación que existe entre el espectrofotómetro y el crecimiento de un
organismo, fueron los principales objetivos que buscaba obtener este
experimento. Para esto se realizó una curva de crecimiento y una prueba de
temperatura. Para la curva de crecimiento se utilizó la turbidez como
una propiedad indicativa para cuantificar el crecimiento, esta medida se
denomina absorbancia. Por otro lado, el efecto que tiene la
temperatura es que las bacterias a menudo crecen a temperaturas donde la tasa
de crecimiento es más rápida, siendo esta la temperatura óptima. Se
construyeron dos curvas de crecimiento a dos temperaturas diferentes 25° C y
37°C utilizando absorbancia, obtenidas del espectrofotómetro. Los resultados demuestran que la temperatura optima para E. coli es
37°C, siendo una bacteria mesofílica. En la observaciones realizadas en
la prueba de temperatura, se puede clasificar a las bacterias B. cereus y B.
subtilis como mesófilas con temperatura optima de 37°C y a Geobacillus
stereathermophillus colocarla en la categoría de bacterias termofílicas con
55°C como sutemperatura óptima.
Introducción
El crecimiento de cultivos de bacterias está dividido en cuatro fases básicas
de crecimiento: de retraso o lag, logarítmica, estacionaria y declinación o
muerte (Tortora, 2007). En la fase lag no hay división celular pero hay gran
actividad metabólica donde está la síntesis de enzimas y diversas moléculas. En
la fase logarítmica es donde comienza la división celular y entra en periodo de
crecimiento, actividad máxima de reproducción celular por lo que es el momento
de mayor actividad metabólica y es la fase preferida en la producción
industrial, aunque en esta las bacterias están mucho más sensibles a
condiciones del ambiente por lo que las condiciones tiene que ser rigurosas. Es entonces en la fase estacionaria, donde el crecimiento
exponencial cesa ya que hay agotamiento de nutrientes, acumulación de desechos
y cambios en pH. En las industrias se usan quimiostato los cuales son
unos aparatos especiales para mantener la fase exponencial indefinidamente ya
que en este se extrae medio gastado y se agrega medio
fresco, esto es conocido como
cultivo continuo. En la fase de muerte, el número de muertes
es más alto que el número de nuevas células formadas (Tortora, 2007).
Además, para cuantificar el crecimiento bacteriano se utiliza un método indirecto que es midiendo la turbidez con un
espectrofotómetro. El cual usa un haz de luz que se
transmite de una suspensión bacteriana a una célula fotoeléctrica. Cuando la
cantidad de bacteria aumenta, menos luz alcanza
lacélula fotoeléctrica. La medición es denominada como absorbancia o densidad óptica y esta se usa para
graficar el crecimiento (Juanto, 2005).
Por otro lado, es importante investigar la respuesta termal de los
microorganismos a los procesos biológicos para observar mecanismos de respuesta
a cambios rápidos y complejos del ambiente (Dell, 2011). Del mismo modo, las bacterias a menudo crecen cerca o en
la temperatura máxima de crecimiento, es decir, a temperaturas donde la tasa de
crecimiento es la más rápida por lo que se le conoce como temperatura
óptima. Sin embargo, varios estudios señalan que la
temperatura tiene mayor influencia en la actividad microbiana que en el
crecimiento y esto tiene gran importancia en industrias de biotecnología y
biorremediación (Margesin, 2009). Asimismo, la temperatura es un parámetro para el control de la sobrevivencia y
crecimiento de patógenos en alimentos (Huff, 2012). En el experimento se
pretende crear una curva de crecimiento, para entender como los microorganismos son afectados por la
temperatura del
ambiente y clasificar la temperatura óptima de crecimiento de varias bacterias.
Materiales y Métodos
La práctica número 1 que se llevo a cabo fue la de la curva de crecimiento:
dinámica de crecimiento de un cultivo de bacteria.
Primeramente, se calibra el espectrofotómetro a 600nm con el medio sin
inocular, el caldo nutritivo. Con una pipeta graduada se mide 1 mL del
caldo nutritivo y se descarga en una celda de plástico, la misma se coloca en
elespectrofotómetro y se le mide la absorbancia. Luego se determina la densidad
óptica del
cultivo, cultivo de E. coli. Con una pipeta graduada se mide 1 mL del cultivo
de E. coli y se descarga en una celda de plástico, la misma se coloca en el
espectrofotómetro y se le mide la absorbancia. Con la lectura de estas
absorbancias se determina cuanto se necesita del cultivo de
Escherichia coli para inocular el medio de cultivo. Para
determinarlo se utiliza la siguiente fórmula Luego
se inoculan los medios de cultivos a 25Ëš y a 37Ëš con la cantidad de mL de
cultivo de E. coli necesario. Con una pipeta graduada se mide 1 mL del caldo
nutritivo con E. coli, se descarga en una celda plástica; la misma se coloca en
el espectrofotómetro y se mide la absorbancia a T0 (0 minutos) de los medios de
cultivos, a las respectivas temperaturas. Se toman lecturas
de absorbancia de cada medio cultivo, con ambas temperaturas, cada 20 minutos.
Se toman lecturas de absorbancia hasta alcanzar 100 minutos.
Se grafican los resultados obtenidos para obtener 2 curvas de
calibración, una correspondiente a cada temperatura.
La práctica número 2 llevada a cabo, trataba del efecto de la
temperatura en el crecimiento microbiano. Se utilizan 4 platos
Petri con un medio de cultivo TSA, los mismos se dividen en 3 secciones. Se
inoculan 3 bacterias distintas: Bacillus cereus, Geobacillus
stereathermophillus y Bacillus subtilis. Cada plato
Petri se coloca a temperaturas diferentes. El primero plato
esta a 4ËšC, elsegundo a 25ËšC, el tercero a 37ËšC y el cuarto a 55ËšC. Luego de 48 horas se observa el crecimiento bacteriano a las
distintas temperaturas.
Resultados y Discusión
Medidas de Absorbancia a 25°C
Tiempo (min) Absorbancia (nm
0 0.026
20 0.035
40 0.051
60 0.088
80 0.129
100 0.202
Tabla 1: Medidas de absorbancia de E. coli a 25°C
Calculo para determinar cuanto se necesita del cultivo de Escherichia coli para
inocular el medio de cultivo.
Medidas de Absorbancia a 37°C
Tiempo (min) Absorbancia (nm)
0 0.025
20 0.041
40 0.073
60 0.186
80 0.263
100 0.355
Tabla 2: Medidas de absorbancia de E. coli a 37°C
4°C 25°C 37°C 55°C
Bacillus cereus no creció creció creció no creció
Geobacillus stereathermophillus no creció no creció creció creció
Bacillus subtilis no creció creció creció no creció
Tabla 3: Crecimiento bacteriano de tres bacterias distintas a temperaturas
diferentes
Grafica 1 : Curva de crecimiento de E.coli a 25°C y 37°C
Figura 1: Plato Petri con Bacillus cereus, Geobacillus stereathermophillus y
Bacillus subtilis a 4°C
Figura 2: Plato Petri con Bacillus cereus, Geobacillus stereathermophillus y
Bacillus subtilis a 25°C
Figura 3: Plato Petri con Bacillus cereus, Geobacillus stereathermophillus y
Bacillus subtilis a 37°C
Figura 4: Plato Petri con Bacillus cereus, Geobacillus stereathermophillus y
Bacillus subtilis a 55°C
En ambas curvas podemos apreciar la fase lag, donde las bacterias aun están
acostumbrándose al medio, y la faselog conocida como la fase de crecimiento
exponencial. También se puede observar como la curva de los 25 grados
Celsius aumenta de manera exponencialmente a partir de los 60 minutos. Sin embargo, en la de los 37 grados podemos ver su aumento a los 40
minutos. Esto demuestra que la temperatura óptima para
E. coli es 37°C. Haciendo los cálculos pertinentes
(T2-T1, donde la absorbancia en T2 es el doble de la absorbancia medida en T1)
obtenemos que el tiempo de generación para esta bacteria es de 20 minutos
(60-40).
Para la segunda practica se utilizaron tres
bacterias: Bacillus cereus, Geobacillus stereathermophillus y Bacillus
subtilis. Pasadas las 48 horas de incubación se observaron los platos Petri con las bacterias y se determinó si hubo
crecimiento o no. Para el plato
en la nevera a los 4°C no hubo crecimiento en ninguna de las tres secciones. Lo
que se observa en la sección de la bacteria B. subtilis es la cantidad de
cultivo que se colocó inicialmente. En el segundo plato,
el de 25°C, la única que no mostró crecimiento fue Geobacillus
stereathermophillus. A los 37°C se observó crecimiento de
parte de las tres bacterias pero solo Geobacillus stereathermophillus fue capaz
de crecer a los 55°C. Con estos resultados podemos clasificar a las
bacterias B. cereus y B. subtilis como mesófilas con temperatura optima de 37°C
y a Geobacillus stereathermophillus colocarla en la categoría de bacterias
termofílicas con 55°C como su temperatura óptima.
Conclusión
En este laboratorio seconcluyó que cada bacteria posee
un patrón particular de crecimiento y actividad metabólica a una temperatura
que favorece la supervivencia de la misma. Se determinó la
clasificación de cada organismo según su temperatura optima de crecimiento.
Según se pudo observar en la práctica #1, la bacteria E. coli tuvo un mejor y más rápido crecimiento a la temperatura de 37oC.
E. coli vive en nuestro tracto digestivo lo que hace que su temperatura óptima
lo sea la del
cuerpo humano (37oC). Esto la hace una bacteria mesofílica.
En la práctica #2, luego de pasadas las 48 horas de incubación se pudieron ver
cambios notables en el crecimiento de las bacterias
trabajadas a medida que se aumentaba la temperatura. Estas
fueron Bacillus cereus, Geobacillus stereathermophillus y Bacillus subtilis.
A 4oC no hubo crecimiento notable en ninguna de las
bacterias, lo que se concluye que ninguna de las bacterias son psicrofílicas.
A temperatura de 25oC solo B. cereus y B. subtilis crecieron, sin embargo
Geobacillus stereathermophillus fue la única incapaz de crecer a esta temperatura. A la temperatura 37oC
se observó crecimiento en todas las bacterias haciendo de esta temperatura la
óptima para su desarrollo, tanto así que podrían caer bajo la clasificación de
bacterias mesofílicas. Solo se observó crecimiento de la bacteria
Geobacillus stereathermophillus en la temperatura alta
de 55oC clasificando esta bacteria como
una termofílica. En resumen; Bacillus subtilis y Bacillus cereus se
clasificarían como
mesofílicas ya queno pudieron sobrevivir a altas temperaturas altas como lo hizo la bacteria Geobacillus stereathermophillus
la cual sería clasificada como
termofílica o termodúrica.
Referencias
Dell, A. I., Pawar, S., Savage, V. M. 2011 Systematic variation in the
temperature dependence of physiological and ecological traits. PNAS. doi:10.1073/pnas.1015178108
Huff, K., Boyer, R., Denbow, C., O'Keefe, S., & Williams, R. (2012).
Effect of storage temperature on survival and growth of foodborne pathogens on
whole, damaged, and internally inoculated jalapeños (capsicum annuum var.
annuum). Journal of Food Protection (2),382-8.
Juanto, S.,
Iasi
,
R., Pastorino, S., Arbeletche, M. (2005). Espectrofotómetro. sQué es un espectrofotómetro Universidad Tecnológica
Nacional. Recuperado el 2 de marzo de 2013 desde:
www.frlp.utn.edu.ar/grupos/aepeq/equipos.pps
Margesin, R. (2009). Effect of temperature on growth
parameters of psychrophilic bacteria and yeasts. Extremophiles,
13(2),
Tortora, Gerard J, Funke, B., Case, C. (2007). Introducción a
la microbiología. Médica Panamericana Novena edición
956(160-200). Recuperado el 2 de marzo de 2013 desde:
