Universidad de Antofagasta
Facultad Ciencias de la Salud
Departamento Biomédico
Bioquímica
Laboratorio N °1: Determinación de la actividad de la enzima lactato
deshidrogenasa
Introducción
La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima NAD dependiente que se encuentra
ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos.
La reacción catalizada por la Lactato deshidrogenasa (LDH) que reviste
importancia es la reducción del acido pirúvico a
acido lactico, cuando se combina con dos atomos de
hidrógeno. Para describir con precisión los sustratos y los
productos del
lactato deshidrogenasa se requiere el desarrollo químico completo de la
reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa, los sustratos de la
LDH son el acido pirúvico y el NADH2 y sus productos son el
acido lactico y el NAD.
La cantidad de enzima LACTATO DESHDROGENASA determina la cantidad de ATP en ausencia
de O2 a las Células, en el caso de las células musculares una
menor cantidad de enzima implicaría una velocidad escasa de
producción de ATP, en algunos animales como la rana leopardo la mayor
velocidad de salto de la rana se debe a la presencia de una mayor cantidad de
enzima lactato deshidrogenasa.
La LDH es una enzima cercana al equilibrio, por tanto, no reguladora, pero
sí regulada por la razón NADH / NAD+ y por la posibilidad de
presentar formas isoenzimaticas concaracterísticas distintas
tanto cinéticas como de inhibición por sustrato. La
inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación de
un complejo NAD - piruvato que compite con el NADH por
el centro activo del enzima. Asimismo, la LDH presenta
inhibición por intermediarios de ciclo tricarboxílico:
oxalacetato y citrato. Se conocen otros inhibidores como oxalato y
oxamato.
Preparación de material biológico, reactivos y
diseño experimental para el estudio de reacciones redox de importancia
en el metabolismo celular.
Objetivo: Determinación de la actividad de la enzima lactato
deshidrogenasa.
Material biológico a preparar
Órganos a requerir: Rata muerta por decapitación.
Preparación de enzima lactato deshidrogenasa: Se obtendra la
enzima a partir de tejidos hepaticos y musculares. En ambos casos, el
hígado y el musculo se cortara en pequeños trozos,
moliéndose en un mortero en presencia de arena que se utilizara como
abrasivo, hasta obtener una pasta fina soluble, utilizandose fosfato de
sodio 10 m M, PH 7.4 como amortiguador. La solución obtenida se
centrifuga 10 minutos a 10.000 rpm en centrifuga refrigerada. El sobrenadante correspondera al extracto que
contendra proteínas y moléculas solubles.
Eliminación de coenzima presente en el extracto: El extracto obtenido de
la forma descrita en le punto 3, se coloca en tubo de ensayo o vaso precipitado
limpio y se mantiene en le mesón por 15 minutos a temperatura ambiente.
La destrucción de la coenzima NADH y de naturalezanucleotidica se
producira por la presencia y actividad a temperatura ambiente de
nucleotidasas presente en el extracto. Una vez transcurrido
el tiempo establecido para la destrucción de las coenzimas, el extracto
se conserva a 5°C.
Preparación de la coenzima NAD: extraer los músculos de pata de
la rata y colocarlos en un vaso de precipitado con 15
ml de agua en ebullición. Este calentamiento tiene por
objetivo destruir las enzimas presentes en el tejido, incluyendo las enzimas
deshidrogenasa lactica y las nucleotidasas, evitando qe estas
últimas degraden la coenzima que es termoestable. continuar la ebullición por 5 min. Enfriar. Como volumen total se ha
reducido, agregar agua en cantidad suficiente para completar alrededor de 15
ml.
Para conseguir anaerobiosis se coloca una capa de vaselina liquida, que
aísla el medio de incubación del aire.
La reacción debe hacerse en anaerobiosis, pues el azul de metileno
reducido se oxida espontaneamente por el oxigeno del aire.
RESULTADOS EXPERIMENTALES
Resultados y discusión
Tubos
Resultados
Discusión
1
Reacciono a los 4 min y 15 seg.
Reacciona a los pocos min pasa de un color azul a una
sustancia decolorada, debido a que el azul de metileno se reduce.
2
No reacciono
No reacciona al esperar unos min la solución se ve de color azul ya que
la enzima en ausencia de la coenzima no puede reaccionar.
3
No reacciono
Se ve el color azul de metileno oxidado ya que no hay enzima.
4
No reacciono
Se ve de color azul oscuro ya que hay ausencia de cianuro que permite el
desplazamiento de la reacción hacia la formación de lactato.
5
No reacciono
Se ve color azul oscuro por la mezcla entre azul de metileno y la enzima ya que
no tiene sustrato. Y la decoloración se detiene
por la vaselina que impide la entrada de oxigeno al tubo.
6
Reacciono a los 3 min y 50 seg.
Reacciona mas rapido en comparación al tubo 1 y se debe a
que tiene mayor concentración de enzima, y pasa de un
color azul a una sustancia decolorada, debido a que el azul de metileno se
reduce.
Reacción de acido lactico
Conclusión
En conclusión para determinar la acción del
lactatodeshidrogenasautilizando azul de metileno, realizamos varios ensayos en
los cuales vemos la actividad de cada reactivo en la reacción final ,
los ensayos 1 y 6 logran la reacción esperada y eso se manifiesta al
reducirse el azul de metileno.
Ademas de entender que el azul de metileno se utiliza como aceptor de
hidrogeno, pues posee la propiedad muy útil de cambiar de color al pasar
de oxidado ha reducido. Es azul de metileno cuando esta
oxidado y blanco (incoloro) de metileno cuando esta reducido. Debido a
que el azul de metileno se oxida espontaneamente por el oxígeno del
aire, la reacción debe hacerse en anaerobiosis. Para ello se ocupa la
vaselina.
Normalmente la reacción es muy lenta, así que
agregamos mas lactato para que se acelere la reacción y podamos
ver el cambio de color mas facilmente.
El cianuro se combina con el hierro presente en la molécula de la
catalasa, por lo tanto tiene un efecto inhibidor.
