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Espectroscopía fluorescencia molecular - Fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia



QUÍMICA ANALÍTICA

Espectrometría de luminiscencia molecular
Fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

ÍNDICE

Introducción………………………………………………………………………..3

1.
Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia…………………………….4

1.1 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia…………4

1.2 Ley cuantitativa de la fluorescencia……………………………………….11

1.3 Variables que afectan a la fluorescencia……………………………………13

2.
Instrumentos para la medida de la fluorescencia y de la fosforescencia………..15

3.
Aplicaciones de los métodos fotoluminiscentes…………………………………19

4.
Quimioluminiscencia……………………………………………………………..20

Bibliografía……………………………………………………………………………21




INTRODUCCIÓN

Se define la luminiscencia como la desactivación de un estado electrónico excitado de átomos o moléculas. El término de luminiscencia recoge todos aquellos métodos ópticos en los que las moléculas del analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cuantitativo y cualitativo. Se pueden distinguir los siguientes tipos de luminiscencia en función del modo en que se excitan las moléculas: Fotoluminiscencia: Las moléculas se excitan por absorción de radiación UV-Vis. Incluye la fluorescencia y la fosforescencia. Es el más utilizado desde el punto de vista analítico. Quimioluminiscencia: Se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada que emite luz cuando vuelve a su estado fundamental o que transfiere su energía a otra especie que, posteriormente, da lugar a una emisión. No necesitafuente de radiación. Bioluminiscencia: Es la luminiscencia que tiene lugar en los organismos debido a un proceso bioquímico. Radioluminiscencia: La radiación ionizante (rayos X, alfa, beta y gamma) son los que provocan la excitación de la molécula. Catodoluminiscencia: Es la excitación molecular mediante rayos catódicos, es decir, debido a la exposición del analito a un haz de electrones. Electroluminiscencia: La excitación se lleva a cabo a través de un campo eléctrico. Termoluminiscencia: Calentamiento de las moléculas para su excitación. Triboluminiscencia: Se emplean fuerzas electrostáticas y de fricción. Sonoluminiscencia: Utilización de ultrasonidos para la excitación molecular.



De entre todos estos métodos analíticos, se van a considerar para su estudio la fluorescencia, la fosforescencia y la quimioluminiscencia, los cuales están íntimamente relacionados.




TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA

El fenómeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie química es excitada por medio de radiación electromagnética y como consecuencia la especie pierde la energía adquirida reemitiendo ésta en forma parcial o total. Esto es, parte de la energía adquirida por la especie química se reemite en forma de choques moleculares y parte en forma de energía luminosa o el total de la energía adquirida se reemite en forma de radiación.

La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. La fosforescencia es el fenómenoque se produce cuando una molécula se excita electrónicamente (absorbancia) y su posterior desactivación transcurre con un cambio de spin en el electrón (pasa del estado singulete a triplete mediante un cruce de sistemas) desde el nivel inferior vibracional del primer estado electrónico excitado al nivel fundamental.

La fluorescencia y la fosforescencia tienen en común el hecho de que la excitación se obtiene mediante la absorción de fotones, lo que conlleva que se conozca a ambos fenómenos con el término más general de fotoluminiscencia.

La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia consiste en que el primer fenómeno no supone un cambio de espín electrónico. Como consecuencia, la fluorescencia presenta un tiempo de vida medio inferior a la fosforescencia, donde el cambio en el espín del electrón hace que la radiación se mantenga durante un tiempo fácilmente detectable.

1.1 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia

Para explicar la fotoluminiscencia es necesario explicar cómo tiene lugar la absorción de la radiación electromagnética de una molécula. Para ello partimos de un diagrama de orbitales moleculares (OM). Dos OM surgen de la combinación de dos orbitales atómicos (OA).


Los OM se dividen en tres tipos: enlazantes, antienlazantes y no enlazantes. Los electrones ocupan los OM de acuerdo con el principio de exclusión de Pauli (sólo dos electrones por cada dos OM, no puede haber dos electrones con el mismo estado cuántico, es decir, con los cuatro números cuánticos iguales), principio de mínima energía (así los electrones ocupan los OM enlazantes y no enlazantes, que son losde menor energía) y principio de máxima multiplicidad de Hund.

En el estado fundamental, los electrones ocupan los OM enlazantes y no enlazantes (los de menor energía). A dicho estado fundamental de la molécula se le denomina estado singlete. Esta denominación viene dada a partir del concepto de multiplicidad de espín, que se define como

M = 2S + 1

M = Multiplicidad del espín. S = |Σsi| = suma total del espín de cada uno de los electrones de la molécula = espín neto de la molécula. si = espín de los electrones = ± ½ Suponemos que en el estado fundamental todos los electrones se encuentran apareados (moléculas diamagnéticas, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos externos). La suma total de los espines, es decir, el espín neto de la molécula, es cero, y la multiplicidad del espín es igual a uno. Es lo que se denomina estado singlete (S0). A partir de ese estado fundamental, por absorción de radiación electromagnética, a una determinada longitud de onda, se promociona uno de los electrones del estado fundamental de los OM enlazantes o no enlazantes a un OM antienlazante. El estado fundamental tiene un nivel energético determinado, que recibe el nombre de nivel energético del estado fundamental. En el caso de la absorción de radiación UV, los electrones se mueven al OM antienlazante.



Para comprender la diferencia entre los dos fenómenos luminiscentes es necesario hacer referencia al espín del electrón y a los estados excitados singlete y triplete.


En el caso de que no se produzca un cambio del espín del electrón que es promocionado al OM antienlazante, el espín neto de la molécula siguesiendo igual a cero (S=0), de manera que M = 1. Se denominan estados excitados singlete. Estos estados contienen más energía que el estado fundamental, y para distinguirlos se les añade un subíndice (1, 2, 3…) según aumente la energía de los estados (S1, S2, S3…). Por el contrario, cuando el electrón promocionado al OM antienlazante cambia el número cuántico de espín en el proceso (por ejemplo, de -1/2 a +1/2), el espín neto de la molécula es igual a uno (S=1) y la multiplicidad del espín es igual a tres (M=3). Este estado electrónico se denomina estado triplete excitado.

El estado triplete excitado se encuentra a un nivel energético inferior al del estado singlete excitado, de forma que, en una escala de energía, se encontraría entre la energía del estado fundamental (S0) y la energía del primer estado singlete excitado (S1). De acuerdo con la regla de selección de los saltos electrónicos, los únicos saltos posibles son aquellos en los que no hay cambio del número cuántico, es decir, que la multiplicidad del espín (M) no cambie. Por tanto, los saltos en absorción molecular tienen lugar entre S0 y S1 o entre S1 y S2, dependiendo de la longitud de onda empleada. No existe probabilidad de salto de S0 a T1 (transición prohibida). Como consecuencia de estos saltos electrónicos se obtienen espectros de absorción molecular, que son bandas.

Estado singlete fundamental

Estado singlete excitado

Estado triplete excitado

Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación de varias etapas mecanísticas.
Dos de estas etapas conllevan la emisión de un fotón de radiación. Las otras etapasde desactivación son procesos no radiantes. La relajación no radiante implica la pérdida de energía a través de una serie de pequeñas etapas en las que la energía de excitación de una molécula se transforma en energía


cinética al colisionar con otras moléculas (se produce un pequeño aumento de la temperatura del sistema). El cambio más propicio hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado.

La fluorescencia de moléculas implica una transición desde un estado excitado de singlete hasta el fundamental de singlete. Esta transición es muy probable, por tanto, la vida media de un estado excitado de singlete es muy breve (10-5 s o menos). El mecanismo de fluorescencia únicamente se observa en determinadas muestras, concretamente alrededor de un 20% de las moléculas orgánicas. Por otra parte, la fosforescencia molecular supone una transición de un estado de triplete excitado al estado fundamental de singlete. Esta transición provoca un cambio en el espín del electrón, por lo que es mucho menos probable. En consecuencia, el estado de triplete tiene una vida media mucho más larga (habitualmente, 10-6 a 1s). La fosforescencia se observa sólo a bajas temperaturas, en medios altamente viscosos o en moléculas que están absorbidas sobre superficies sólidas.

A partir de los diagramas de OM y de energía de los estados singlete y triplete se puede explicar el fenómeno de la fotoluminiscencia. No obstante, hay que incluir los niveles vibracionales de cada nivel electrónico. Esto es lo que se denomina diagrama de Jablonski. Un diagrama de Jablonski es aquel diagrama de energía queincluye tanto los niveles electrónicos como los vibracionales. Se encuentra representado en la siguiente imagen (ilustración 1).


Ilustración 1. Diagrama de Jablonski.

La línea horizontal S0 representa la energía del estado fundamental de la molécula, el cual normalmente es un estado singlete. A este nivel electrónico, igual que en los otros estados excitados, se encuentran asociados varios niveles vibracionales de la molécula. A temperatura ambiente, este estado representa la energía de prácticamente todas las moléculas en una disolución. Las dos líneas de la izquierda representan S1 y S2, que corresponden al primer y al segundo estado singulete excitado respectivamente. El de la derecha, T1, corresponde al primer estado triplete excitado. Como se puede ver, el diagrama confirma que el estado triplete es menos energético que el correspondiente estado excitado singlete.

A partir del diagrama se pueden estudiar los procesos de desactivación por los cuales una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación de varias etapas mecanísticas. Los dos mecanismos fundamentales son la relajación (desactivación) no radiante y la relajación fluorescente.


Relajación vibracional

Relajación no radiante Conversión interna

La relajación vibracional, señalada por las flechas onduladas cortas entre los niveles de energía vibracionales, tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energía vibracional se transfiere a las moléculas del disolvente en una serie de etapas como se indica en la figura. Laganancia de energía vibracional del disolvente se refleja en un ligero incremento de la temperatura del medio. La relajación vibracional es un proceso tan eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es de 10-15s aproximadamente. También se puede dar el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado electrónico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrónico. Este tipo de relajación, llamado conversión interna, se representa con las flechas onduladas largas. En la figura se ilustra el otro proceso de relajación: la fluorescencia molecular. Se puede observar que las bandas de radiación se producen cuando las moléculas fluorecen, debido a que las moléculas electrónicamente excitadas se pueden relajar desde el estado electrónico excitado singlete de menor energía (S1) a cualquiera de los estados vibracionales del estado electrónico fundamental (Regla de Kasha).No obstante, existen ciertas moléculas en las que la fluorescencia se produce desde el estado S2 hasta el estado S0 sin pasar por ningún otro nivel. La fluorescencia es un mecanismo de emisión espontánea. De igual forma que las bandas de absorción molecular, las bandas de fluorescencia molecular están formadas por una multitud de líneas espaciadas tan estrechamente que son muy difíciles de resolver. Empíricamente se observa que el comportamiento fluorescente lo presentan con más frecuencia compuestos en los que la transición es del tipo π, π* ya que tales transiciones presentan tiempos de vida promedio más cortos y no aquellos compuestos en los que la transición de menor energía es del tipo n *; esto es, la eficacia cuántica es mayor para transiciones π, π*.


La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas que incorporan características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación sin radiación se reduzcan hasta el punto que la reacción de emisión puede competir cinéticamente. Como ya se ha dicho anteriormente, el camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida media del estado excitado. Por tanto, si la desactivación por fluorescencia es rápida con respecto a los procesos sin radiación, se observa tal emisión. Por otro lado, si un camino sin radiación tiene una constante de velocidad favorable, la fluorescencia no tiene lugar o es menos intensa. Por ende, la larga vida media de la fosforescencia es una de sus desventajas. Es posible que procesos no radiantes compitan con la fosforescencia y desactiven el estado excitado. Así pues, la eficiencia del proceso de fosforescencia y su intensidad son relativamente bajas. A fin de aumentar esta eficiencia, se trabaja a bajas temperaturas y en medios rígidos.

Como ejemplo de estos mecanismos de desactivación que pueden competir con la fluorescencia y con la fosforescencia, se tienen los siguientes: transferencia de carga intramolecular, cambio conformacional de la molécula, transferencia electrónica, transferencia protónica, transferencia de energía, formación de complejos y transformación fotoquímica.

En la figura 2, se observa que en la absorción los saltos de energía se producen desde el nivel vibracional más bajo del estadoelectrónico fundamental hasta distintos niveles vibracionales del nivel electrónico excitado y, en la fluorescencia, se producen desde el nivel vibracional más bajo del estado excitado (ya que previamente se ha producido una relajación vibracional de mayor velocidad) hasta los distintos niveles vibracionales del estado electrónico fundamental. Esto significa que en la fluorescencia los saltos energéticos son más pequeños, como consecuencia de lo cual las longitudes de onda correspondientes son más grandes con respecto a la absorción. Este desplazamiento hacia longitudes de onda mayores es lo que se conoce como desplazamiento de Stokes. Los procesos en los que la radiación absorbida sea emitida sin cambio en la longitud de onda (misma energía) se conocen como radiación de resonancia o resonancia fluorescente. Esto sólo tiene lugar en el salto energético desde el nivel más bajo del estado excitado al más alto del estado fundamental.


Debido a que las diferencias de energía entre los estados vibracionales son aproximadamente las mismas, tanto absorción como en emisión, frecuentemente aparece el espectro de excitación (absorción) como una imagen especular del espectro de fluorescencia (emisión) con una sobreposición que ocurre en la línea de resonancia, es decir, en la línea a la que la radiación absorbida sea emitida sin cambio de longitud de onda.

Ilustración 2. Desplazamiento de Stokes.

1.2 Ley cuantitativa de la fluorescencia

Suponiendo que se tiene una muestra fluorescente de concentración C en la cual se hace incidir una determinada radiación de intensidad I0. Parte de la radiación incidente será absorbida por lamuestra y parte será transmitida. La intensidad absorbida por la muestra será

IA = I0 - IT

I0 IF

IA

IT


Además, I0 e IT están relacionados por la ley de Lambert-Beer, donde la relación entre ambos es exponencial y depende, no sólo de la concentración de la muestra (C), si no de la cubeta utilizada (b = paso óptico) y del coeficiente de absorción molecular (É›, depende de la λ y es característico de la especie absorbente). T = I T/I0 = e-2.3É›bC → IA = I0 (1- e-2.3É›bC) La intensidad de la fluorescencia (IF) depende de tres parámetros: - De IA (intensidad de absroción) - De k, que es función del instrumento utilizado para tomar las medidas - De ɸF, que es el rendimiento cuántico de fluorescencia, y se define como el número de fotones emitidos frente al número de fotones absorbidos por unidad de tiempo. Este parámetro toma valores comprendidos entre 0 y 1, siendo 0 para una molécula que no emite fluorescencia y 1 para aquella que emita lo mismo que absorba. Es un parámetro característico de cada molécula, no depende de la longitud de onda de absorción ni de emisión.
n° fotones emitidos/t

Ley de Lambert-Beer:

IT = I0 (e-2.3ɛbC)

IF = k ɸF IA

ɸF =
n° fotones absorbidos/t

IF = k ɸF I0 (1- e-2.3É›bC) → Es una relación NO LINEAL Desarrollando el término exponencial como una serie de McLaurin, se comprueba que si la absorbancia (A= É›bC) es menor a 0’05, se pueden despreciar todos los términos de la serie exceptuando el primero, de modo que: (1- e-2.3É›bC) ≈ 2’3É›bC Introduciendo esta nueva relación en la ecuación de la intensidad fluorescente se tiene una relación lineal.

IF = k ɸF I02’3É›bC →Relación LINEAL


1.3 Variables que afectan a la fluorescencia • Rendimiento cuántico꞉ El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia es simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas. Las moléculas altamente fluorescentes, por ejemplo, la fluorisceína, tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas condiciones, se aproximan a la unidad. Las especies no fluorescentes tienen eficiencias que son prácticamente cero. • Estructura: La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos (π→π*). Los compuestos que contienen estructuras alifáticas y alicíclicas(o heterocíclicas: n→π*) o estructuras con dobles enlaces muy conjugados pueden presentar también fluorescencia. La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución, la eficacia cuántica aumenta con el número de anillos y con su grado de conjugación(o grado de condensación). La sustitución en un anillo aromático causa desplazamientos en la longitud de onda de absorción máxima y los cambios correspondientes en los picos de fluorescencia. Además, la sustitución de halógenos también afecta la eficiencia de la fluorescencia por el efecto del átomo pesado, que aumenta la probabilidad para el cruce entre sistemas hacia el estado triplete, disminuyendo así la fluorescencia de la molécula. • Rigidez estructural: Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Por ejemplo, las eficacias cuánticas para elfluoreno y el bifenilo están próximas a 1'0 y 0'2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida. La influencia de la rigidez también tiene importancia en el aumento de la fluorescencia de ciertos quelatantes orgánicos cuando están formando un complejo con un ion metálico. La falta de rigidez de la molécula provoca un aumento de la velocidad de conversión interna y el correspondiente aumento en la probabilidad de desactivación no radiante.

• Temperatura y disolvente: La eficacia cuántica de la fluorescencia disminuye en muchas moléculas con el aumento de la temperatura, ya que el aumento de la frecuencia de las colisiones a temperatura elevada hace aumentar la probabilidad de desactivación no radiante (conversión externa). Una disminución en la viscosidad del disolvente también aumenta la probabilidad de conversión externa y produce el mismo resultado. • Efecto del pH: La fluorescencia se ve muy afectada por la influencia del pH, ya que la emisión puede ser mayor o menor en un medio ácido o básico. La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende normalmente del pH. Tanto la longitud de onda como la intensidad de emisión son diferentes para la forma ionizada y no ionizada del compuesto. Los cambios en la emisión de los compuestos de este tipo surgen del distinto número de especies resonantes asociadas con las formas acidas y básicas de las moléculas. Cuanto mayor es el número de formas resonantes, mayor es la estabilidad del primer estado excitado; la consecuencia es una fluorescencia en la región ultravioleta. Por lo tanto, será muy frecuente en losmétodos fluorimétricos el control estricto del pH. La constante de disociación ácida para la molécula excitada difiere de la constante de la misma especie en el estado fundamental. • Efecto de la concentración: Cuando la concentración es suficientemente elevada como para que la absorbancia multiplicada por 2'303 sea mayor que 0'05, no se pueden despreciar los términos de la serie de McLaurin como se había hecho en el apartado de rendimiento cuántico de fluorescencia y la linealidad se pierde; entonces F toma un valor inferior al obtenido en la extrapolación de la línea recta de la representación gráfica. Otros dos factores, responsables también de las desviaciones negativas a elevadas concentraciones, son la autoamortiguación y la autoabsorción. El primero es el resultado de colisiones entre moléculas excitadas, a mayor concentración, mayor probabilidad de choche y, por tanto, mayor transferencia de energía por vía no radiante. La autoabsorción tiene lugar cuando la longitud de onda de emisión se solapa con un pico de absorción, momento en el cual la fluorescencia disminuye; porque la radiación emitida atraviesa la disolución y es reabsorbida por otras moléculas fluorescentes.

• Efecto del oxígeno disuelto (Atenuador): Debido al paramagnetismo de la molécula de oxígeno, ésta tiende a desactivar cualquier estado activado por oxidación fotoquímica de la especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las moléculas excitadas al estado triplete, por lo que es deseable que el oxígeno no se encuentra presente en solución o que su concentración sea mínima. Un atenuador es una molécula conpropiedades paramagnéticas que favorece el cruce intersistema (del estado singlete al triplete). • Otras variables: Polaridad, potencial eléctrico, presión y enlaces de hidrógeno.

2.

INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Y LA

FOSFORESCENCIA

Los distintos componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros UV-Vis. La ilustración 3 muestra la configuración característica de los fluorímetros y los espectrofluorímetros. Los instrumentos de fluorescencia suelen emplear ópticas de doble haz, muy útiles para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa primeramente a través de un filtro (el instrumento recibe el nombre de fluorímetro) o un monocromador (se trata entonces de un espectrofluorímetro) de excitación, que transmite la radiación que provocará la fluorescencia limitando la longitud de onda de la radiación fluorescente. La radiación fluorescente emitida por la muestra va a propagarse en todas las direcciones, no obstante, lo más conveniente es tomar la medida desde un ángulo de 90s con respecto al haz de excitación, ya que de ese modo se evita que la dispersión producida por la disolución y las paredes de la cubeta interfiera con la radiación emitida por la especie fluorescente, provocando así grandes errores en la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector tras haber pasado previamente por otro filtro o monocromador que ha aislado la fluorescencia para su medida. A continuación


el haz de referencia pasa a través de un atenuador quereduce su potencia a, aproximadamente, la radiación fluorescente. Las señales procedentes del

fotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un registro.

Ilustración 3. Componentes de un fluorímetro o un espectrofluorímetro. El instrumento se compone de: • Fuente de radiación luminosa: Generalmente se emplea una lámpara de descarga de xenón de alta potencia, la cual emite una intensa radiación policromática continua en la región 240-1700 nm. El espectro de la lámpara es parecido al de un cuerpo negro. También pueden utilizarse láseres para medidas de fotoluminiscencia. • Sistema de monocromación: También llamado selector de longitud de onda de excitación. Se trata de un monocromador de red de difracción (sencilla o doble). Se acompañan de rendijas de ancho variable con el fin de actuar sobre la resolución y sensibilidad del análisis. Además, con frecuencia se emplean filtros


de corte en el sistema óptico de emisión con el fin de impedir la entrada de la intensa radiación de excitación en el monocromador de emisión. • Cubeta: Se emplean tanto cubetas cilíndricas como rectangulares, de vidrio o de sílice. En fluorescencia se utilizan celdas de vidrio común cuando la radiación que se maneja es de rango visible. Para ultravioleta es necesario utilizar sílice o cuarzo. Es importante el diseño del compartimento de la cubeta, procurando que la dispersión de radiación sea mínima. Así mismo, se debe evitar dejar huellas dactilares en las paredes, ya que la grasa de la piel con frecuencia fluoresce. • Segundo sistema de monocromación: Tambiénllamado selector de longitud de onda de emisión. Tiene las mismas características que el de excitación: a cada monocromador le siguen una rendija y un filtro respectivamente. • Detector: Se coloca formando un ángulo de 90s con respecto a la fuente para evitar la interferencia de la radiación de excitación y que mida sólo el espectro de emisión, es decir, lo que ha absorbido la muestra. Por lo general se emplea un tubo fotomultiplicador, por la gran sensibilidad que muestran estos dispositivos a bajos niveles de luz. • Sistema de amplificación de la señal y lectura de la misma.

Calibrado del instrumento: Debido a las variaciones de la intensidad de la fuente, de la sensibilidad del detector y de otras variables instrumentales, es imposible obtener, a partir de un

espectrofluorímetro determinado, exactamente las mismas lecturas de un día para otro para una disolución o un conjunto de disoluciones. Es una práctica habitual calibrar el instrumento y ajustarlo al nivel de sensibilidad reproducible. El calibrado suele llevarse a cabo con una disolución patrón de un fluoróforo estable.


Características del método: Los métodos fluorescentes y fosforescentes son aplicables a intervalos de concentración más bajos que en las medidas espectrofotométricas de absorción y se encuentran entre las técnicas analíticas más sensibles (los límites de detección son del orden de ppb). La sensibilidad de un método fluorímetro puede mejorarse aumentando la I0 mediante la amplificación adicional de la señal de fluorescencia. Los métodos fluorimétricos tienen sensibilidades que son de uno a tres órdenes de magnitud superiores a loscorrespondientes de absorción. Debido a su elevada sensibilidad pueden sufrir interferencias procedentes de la matriz de la muestra. La precisión y exactitud son considerablemente buenas, aunque más pobres que las de los procedimientos espectrofotométricos. La selectividad que proporcionan los espectrofluorímetros es buena y, por ello, se utilizan para investigaciones relacionadas con las características electrónicas y estructurales de las moléculas.

Por tanto, se puede concluir que, en comparación con la absorción, las fuentes empleadas en fluorescencia son más potentes. Esto se debe a que la energía emitida va a ser proporcional a la intensidad de la fuente, mientras que en la absorbancia prácticamente es independiente de tal intensidad. Como consecuencia, los métodos de fluorescencia son de uno a tres órdenes de magnitud más sensibles que los basados en absorción. Las lámparas de arcos de xenón y xenón-mercurio, así como los láseres son fuentes de fluorescencia habituales. Los monocromadores y transductores suelen ser similares a los usados en espectrofotómetros de absorción. En general, los instrumentos de fluorescencia son más costosos que los de absorción a igual calidad. En el caso de la fosforescencia, la instrumentación también es algo más complicada que la dispuesta para la fluorescencia. Muchos instrumentos de fluorescencia tienen incluidos los denominados fosforoscopios, que permiten que estos mismos instrumentos puedan ser utilizados en medidas de fosforescencia.


3. APLICACIONES DE LOS MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES Los métodos fotoluminiscentes son especialmente útiles en la detección y cuantificación deespecies debido a su inherente sensibilidad. Cabe señalar la existencia de dos aplicaciones de carácter general.

• Determinación de especies inorgánicas: Los métodos fluorimétricos de determinación de especies inorgánicas pueden ser de dos tipos. Los métodos directos, que implican la formación de un quelato fluorescente y la medida de su emisión, y un segundo grupo, los métodos indirectos, que se basan en la disminución de la fluorescencia que resulta de la acción atenuadora de la sustancia que va a ser determinada. Esta última técnica ha sido más ampliamente utilizada en la determinación de aniones. Existen dos factores que limitan el número de iones de metales de transición que van a dar lugar a quelatos fluorescentes: deben ser paramagnéticos y presentar muchos niveles de energía poco espaciados. Los reactivos fluorimétricos que más éxito tienen para el análisis de cationes son los que presentan estructuras aromáticas con dos o más grupos funcionales dadores que permitan la formación de quelatos con el ion metálico, como son la benzoína, el flavanol, o la 8-Hydroxiquinolina. • Determinación de especies orgánicas y bioquímicas: El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas y bioquímicas es muy elevado. Existen métodos para la determinación de sustancias tales como enzimas, agentes medicinales (quinina, fluoroquinolonas), productos naturales, esteroides, vitaminas (vitamina A), hidrocarburos aromáticos policíclicos (antraceno, fenantreno), aminoácidos (fenilalanina, triptófano), etc. Sin lugar a dudas, las aplicaciones más importantes de la fluorimetría están en el campo del análisis deproductos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales. La sensibilidad y selectividad del método lo hace una herramienta particularmente valiosa en estos campos.


4. QUIMIOLUMINISCENCIA

La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una molécula excitada electrónicamente, la cual emite luz conforme regresa al estado fundamental. Las reacciones de quimioluminiscencia ocurren en diversos sistemas biológicos, donde el proceso suele denominarse bioluminiscencia.

La sencillez de la instrumentación es una de las características más atractivas de la quimioluminiscencia para aplicaciones analíticas. No se necesita una fuente externa de radiación para fines de excitación, de modo que el instrumento consistiría sólo en un vaso de reacción y un tubo fotomultiplicador. En general, tampoco se requiere un dispositivo de selección de longitud de onda, ya que la única fuente de radiación es la reacción química. Los métodos de quimioluminiscencia se caracterizan por su alta sensibilidad. Los límites de detección suelen variar de partes por millón a partes por billón o menos. Las aplicaciones abarcan la determinación de gases, como los óxidos de nitrógeno, ozono y compuestos de azufre; determinación de especies inorgánicas en fase liquida, como el peróxido de hidrógeno y algunos iones metálicos; y análisis de especies orgánicas.


BIBLIOGRAFÍA

Skoog, Douglas A Holler, F. James; Nieman, Timothy A. ꞉ “Principios del Análisis Instrumental”. V Edición. Ed. Mc Graw Hill. 2001

Navarro Villoslada, Fernando. Seminario de Fluorescencia Molecular. UCM. Diciembre 2010.





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