I. PARTIE EXPÉRIMENTALE.
1. TECHNIQUE DE CULTURE IN VITRO DU SAINTPAULIA.
Le Saintpaulia est originaire des forêts tropicales africaines. Il en existe actuellement une vingtaine d’espèces dont la plus répandue chez les pépiniéristes français est Saintpaulia ionantha. Cette plante d’appartement ou de serre tempérée exige une température minimale de 16°C en hiver. Sa culture est donc très facile en appartement. Elle préfère la mi-ombre au soleil direct, celui-ci décolorant d’ailleurs ces feuilles.

1° OBJECTIF.
L’objectif de cette expérience est de comprendre la technique de culture in vitro et son processus physiologique (nous partons d’un morceau de feuille puis au fur et à mesure du temps nous obtenons une plante complète en tout point identique à la plante initiale).

2° PRINCIPE.
Nous allons prélever un fragment de feuille sain sur un Saintpaulia puis, après l’avoir désinfecté et rincé, nous placerons ce fragment dans un premier milieu de culture où il pourra se développer. Dès qu’une touffe de microfeuilles sera assez importante nous placerons l’explant dans un second milieu où pourront se développer les racines.
Lorsque les racines seront assez longues, nous transférerons l’explant en terre, porté ensuite sous serre avant d’être laissé à l’air libre.
3° EXPLICATIONS.
La multiplication végétative in vitro du Saintpaulia est une reproduction asexuée (reproduction végétative artificielle) qui permet la multiplication identique d’une plante mère en plusieurs autresplantes. Dans des conditions aseptiques, nous maitrisons absolument cette multiplication et au besoin nous pouvons faire varier les conditions physiques (lumière, température, hygrométrie ) et la composition chimique du milieu.
a - Préparation et désinfection du plan de travail.
Nous nous lavons soigneusement les mains et les avant-bras au savon. Ensuite, nous nettoyons le plan de travail à l’eau de Javel, le bec Bunsen est placé au centre de cette zone désinfectée et est allumé. Les instruments (pince, cutter, ciseaux ) sont également désinfectés dans l’alcool à brûler.
Avant de commencer la manipulation, il faut préalablement passer les instruments dans la flamme du bec Bunsen, puis lors de chaque utilisation leurs extrémités sont plongées dans l’alcool et passées dans la flamme. Pendant la manipulation, nous ne devons jamais toucher les extrémités des instruments ou la feuille de Saintpaulia pour éviter tous risques de contaminations extérieures.
b - Désinfection de la feuille de Saintpaulia.
Tout d’abord la feuille est débarrassée de son pétiole (extrémité de la feuille) puis lavée à l’eau du robinet. Ensuite chaque feuille est traitée séparément. On les désinfecte en les mouillants environ 5 minutes dans un liquide vaisselle, puis dans une solution désinfectante comme de l’eau de Javel. Nous procédons ensuite au rinçage : nous mettons la feuille successivement dans 4 verres d’eau déminéralisée et stérile pendant 5 minutes.
c - Mise en culture.
Nous découpons tout d’abord un morceau de la feuille prélevéed’un Saintpaulia (explant). Nous posons le flacon horizontalement sur un support, nous ouvrons le flacon contenant le milieu de culture SP1 (milieu qui contient les éléments nutritifs nécessaires au développement (boursouflures et excroissances) de l’explant) à proximité de la flamme et nous posons le bouchon sur un tampon imbibé d’eau de Javel pour garder la stérilité du matériel. Ensuite, nous flambons l’encolure du flacon. Avec la pince, nous plaçons l’explant dans celui-ci sur le milieu de culture et on repasse l’encolure du flacon dans la flamme, puis on le referme. Et enfin nous conservons le flacon horizontalement à 20-25°C, à la lumière du jour en évitant l’ensoleillement direct qui brûlerait la plante. L’éclairage artificiel direct est déconseillé car les lampes provoquent des surchauffes localisées.
4° ÉVOLUTION ET RÉSULTATS DE LA CULTURE.
a - Évolution sur le milieu SP1.
Au bout de 8 à 10 jours, l’explant commence à gonfler mais c’est au bout de 4 à 6 semaines qu’apparaissent des microfeuilles vertes de quelques millimètres. Au bout de 4 semaines, nous observons des boursouflures et des excroissances. Cela est dû à une multiplication cellulaire, on obtient alors un cal (amas) de microfeuilles. Quand les touffes commencent à être plus grandes, nous pouvons soit les diviser et les repiquer sur le milieu SP1 et donc procéder à la micropropagation, soit les transférer sur le milieu d’enracinement SP2 (milieu de culture contenant les éléments nutritifs nécessaires à ladifférenciation des cellules et dont à la création de racines).

b - Évolution sur le milieu SP2.
Le cal de microfeuilles, ainsi obtenu est divisé en deux, en prenant les mêmes précautions de stérilité que précédemment. Nous mettons ensuite chaque morceau dans le milieu SP2 pour l’enracinement.

c - Mise en terre de la plante.
La plante ainsi obtenue possède suffisamment de racines pour être autonomes. Nous allons donc procéder à la mise en terre de la plante. Nous extrayons donc précautionneusement la plante du flacon. Sur la terre, nous pouvons mettre un peu de milieu SP2 préalablement prélever du flacon sur la terre, pour renforcer les chances de survie de la plante, qui sont à ce stade assez faible.

5° CONCLUSIONS.
Nous aboutissons donc à la conclusion au bout de ces quelques mois d’expérience - après avoir réussi à obtenir des plants de Saintpaulia - au fait que la culture in vitro permet la création d’une plante identique à la plante mère. Cette culture permet d’obtenir une plante à partir d’un simple morceau de feuille, qui après, des boursouflures et des excroissances, dû à la multiplication et à la différenciation cellulaire, va faire ses propres racines et être autonome. L’avantage de cette culture est que l’on peut obtenir des plantes plus rapidement que par voies naturelles et cela indépendamment des saisons, de plus, en grande quantité, dans de bonnes conditions. Mais en opposition à cela, l’inconvénient de cette technique est le nombreimportant d’échecs de cultures (surtout à notre échelle) qui se produisent au cours des différentes étapes de cette reproduction asexuée, avant la création d’une plante saine. Mais à une plus grande échelle, nous pouvons cependant dire que la culture in vitro est très bien maitrisée de nos jours et que son efficacité n’est plus à démontrer.
6° CRITIQUES.
Si de nombreuses personnes n’ont pas eu de Saintpaulia après cette expérience, cela est dû au fait que cette technique de mise en culture est très dure à réaliser dans les bonnes conditions (à notre échelle en particulier). L’échec de ces cultures s’est produit à tous les stades de l’expérience. Nous avons pu constater que certains fragments de feuilles sur les milieux SP1 n’avaient pas pris, car ils ne touchaient pas assez la gélose nutritive. On a également pu observer des moisissures dans les flacons parce que les conditions de stérilité n’avaient pas été respectées.
Et lorsque les jeunes plantes avaient survécu à tous ces dangers, il restait la mise en terre qui était le plus grand risque. D’ailleurs d’autres plantes n’ont pas survécu à cette dernière opération.

2. SUR QUELS VÉGÉTAUX ?
Le but de la culture in vitro des végétaux, est d’obtenir à partir d’une plante, plusieurs autres plantes génétiquement identiques à la première. Pour cela nous cultivons un fragment de la plante initiale sur un milieu nutritif artificiel.
Ici, nous avons tenté l’expérience avec un fragment de feuille de Saintpaulia mais il aurait tout à fait été possible defaire cette expérience avec une autre plante, car les cellules végétales ont la propriété d’être totipotentes, c’est-à-dire qu’elles sont capables de régénérer un individu complet à partir de n’importe quelle cellule de leur organisme. Il aurait donc suffit de prélever un morceau quelconque d’un autre végétal et de le cultiver in vitro pour avoir sa copie conforme. C’est ce que nous allons essayer de démontrer avec l’expérience suivante :
ÉTUDE DE LA MULTIPLICATION CELLULAIRE D’UN VÉGÉTAL.
OBJECTIF.
Nous étudions la multiplication cellulaire d’un végétal autre que le Saintpaulia. Ici nous traitons le cas d’un méristème (tissus végétal formé de cellules indifférenciées, siège de divisions rapides et nombreuses situé dans les régions de croissance de la plante) de racines d’oignon pour essayer de démontrer que la multiplication cellulaire est censée être la même pour tous les végétaux et, pour aussi expliquer comment notre bout de feuille initial à pu croitre et donner naissance à une plante entière.
PRINCIPE
Nous procédons à une coloration des racines d’oignon pour, pouvoir, ainsi observer les différents stades de la mitose (mode usuel de division de la cellule vivante, assurant le maintien d’un nombre constant de chromosomes), après que ce stade du cycle cellulaire est été bloqué par un fixateur.
PROTOCOLE.
Préparation de cellules de racines d’oignon (coloration de FEULGEN).
Les racines d’oignon ont été mises en germination 4 à 5 jours avant la séance. Lorsque les racines ont 1,5 cm de long, nous lescoupons à 1 cm de la pointe, puis nous les séchons et nous les mettons dans le fixateur (l5 ml d’éthanol absolu + 5 ml d’acide éthanoïque glacial). Les cellules sont mortes, le fixateur bloque la mitose. 24h avant la séance nous mettons 20 ml d’HCL N (acide chlorhydrique à 1 mole par litre) à l’étuve, à 60° C
PRÉPARATION DE LA FUSCHINE (colorant rouge).
- 1 g de fuchsine basique diamant dans 20 cl d’eau distillée bouillante. Bien mélanger.
- Refroidir jusqu’à 50°C.
- Filtrer.
- Ajouter 20 ml d’HCl N et refroidir à 25°C.
- Ajouter 1 g de bisulfite de potassium. Boucher. Laisser à l’obscurité.

Le jour de la séance, nous récupérons les apex (pointe, sommet de la racine où se trouve les cellules chromosomiques) sur un tamis et nous les rinçons sous un filet d’eau. Nous les séchons sur un papier filtre. Nous les mettons dans le HCl N (placé depuis 24h à 60°C) pendant 12 minutes. Nous récupérons les apex sur un tamis, Nous rinçons sous un filet d’eau, nous les séchons sur un papier filtre et nous les plaçons 15 minutes dans la fuchsine.

Avec le manche de l’aiguille lancéolée, nous écrasons les apex pendant deux minutes. Nous montons entre lame et lamelle dans l’acide éthanoïque à 45%. Nous observons au microscope.
RÉSULTATS.
Une cellule qui se divise correspond à une transmission de l’information génétique. Cette division s’opère en quatre phases :
- La phase G1, qui correspond à une croissance de la cellule durant laquelle est synthétisé le matériel cellulaire.
- La phase S, au cours de laquelle la celluledouble son stock d’ADN (synthèse de la deuxième chromatide).
- La phase G2, pendant laquelle la croissance cellulaire se poursuit.
- La mitose, processus qui aboutit à la division de la cellule mère en deux cellules filles identiques.
On observe ainsi les stades de la mitose :
1. Prophase.
Condensation de la chromatine :
Les chromosomes sont visibles à l’état de filaments. Disparition de l’enveloppe nucléaire. Apparition d’un fuseau de fibres entre deux pôles de la cellule.

2. Métaphase.






Les chromosomes se regroupent dans la plan équatorial au niveau du centromère.


3. Début d'anaphase.

4. Fin d'anaphase.


Les deux chromatides de chaque chromosome s’écartent l’une de l’autre.
Elles migrent vers les deux pôles de la cellule.


5. Télophase.


Les chromatides à chaque pôle retournent à l’état de chromatine. Reconstitution de l’enveloppe nucléaire.
Le fuseau de division disparait accompagné d’une division du cytoplasme entre les deux noyaux fils.


CONCLUSION
Nous pouvons donc observer les différents stades de mitose pour les racines d’oignon, la multiplication cellulaire s’opère donc bien chez tous les végétaux, les caractéristiques génétiques du végétal sont conservées ce qui permet l’action éventuelle de la culture in vitro sur ces végétaux. De plus, cette observation explique le fait que notre explant a pu se développer dans le milieu SP1. Si les microfeuilles ont augmenté cela est uniquement dû à la multiplication des cellules.