LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA APLICADA

PRACTICA #13
“METABOLISMO BACTERIANO”.



OBJETIVO

Conocer el metabolismo de dos bacterias, así como otras actividades bioquímicas, que serviran de criterio para clasificarlos e identificarlos.

INTRODUCCIÓN

Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos se les conoce como metabolismo y consiste de un gran número de reacciones químicas destinadas a transformar las moléculas nutritivas en elementos que posteriormente seran utilizados para la síntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las proteínas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energía que esta contenida en una reacción química en algún proceso que requiera de energía, como puede ser el trabajo o el movimiento.

El término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que tiene lugar en la célula, y tiene 3 funciones específicas a saber:

- Obtener energía química del entorno, almacenarla, para utilizar luego en diferentes funciones celulares.
- Convertir los nutrientes exógenos en unidades precursoras de los componentes macromoleculares de la célula bacteriana.
- Formar y degradar moléculas necesarias para funciones celulares específicas, como por ejemplo, movilidad y captación de nutrientes.

El metabolismo tiene lugar a través de secuencias de reacciones catalizadas enzimaticamente, y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual la célula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como anabolismo, y como resulta en la producción de nuevo material celular, también se denomina biosíntesis.La biosíntesis de un proceso que requiere energía, por lo tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla en su entorno para crecer y, eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradativas de los nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidades precursoras de la biosíntesis, se conoce como catabolismo.

Los 2 tipos de transformaciones químicas que ocurren simultaneamente en la bacteria, y así el metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones. Las reacciones catabólicas resultan en la liberación de la energía química contenida en los nutrientes, mientras que las anabólicas la consumen. Por lo tanto la energía liberada como resultado de las reacciones de óxido-reducción del catabolismo debe ser almacenada y transportada de algún modo. Una forma es como compuestos con uniones fosfato de alta energía y son éstos los que luego sirven como intermediarios en la conversión de la energía conservada en trabajo útil. El compuesto fosfato de alta energía mas importante en los seres vivos es el adenosintrifosfato (ATP). Este se genera en la célula bacteriana por 2 procesos diferentes, llamados: fosforilación a nivel del substrato y fosforilación oxidativa.

“EFECTO DEL OXÍGENO MOLECULAR SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO”

MATERIAL Y SUSTANCIAS

- 2 Cultivos puros en caldo nutritivo
- 2 Tubos de ensayo conteniendo agar nutritivo
- 2 Aplicadores estériles
- Gradilla
- Baño de agua a temperatura constante de 45°C
- Mechero Bunsen
- Cerillos o encendedor
- Tripié
- Tela de asbesto
- Vaso de precipitados de 600 mL

TÉCNICA

1 Fundir el agar contenido en los tubos, en baño de agua y mantenerlo a una temperatura de 45°C.

2.- Inocular en condiciones asépticas los tubos con agar fundido y a 45°C a partir de los cultivos puros (uno para cada tubo de agar), en la siguiente forma:
Introducir el aplicador al tuboque contiene el cultivo bacteriano, cuidando que cuando menos la mitad del aplicador se impregne con el cultivo.
Enseguida introducir el aplicador contaminado hasta el fondo en el tubo de agar fundido a 45°C y moverlo de un lado a otro para distribuir bien las bacterias en el agar.
Tapar el tubo y colocarlo en una gradilla para que se solidifique en forma vertical.
Incubar a 37°C por 24 horas.

observar después de este período a que altura creció la bacteria sembrada: en la superficie o en el fondo o bien en todo el tubo.

Anotar resultados y sacar conclusiones.

“ETABOLISMO DE CARBOHIDRATOS”

MATERIAL Y SUSTANCIAS

- 2 juegos de tubos de fermentación (con campana Durham), conteniendo carbohidratos – glucosa, lactosa, sacarosa, galactosa, rafisona, manosa, maltosa, etc. – en caldo con rojo de fenol como indicador. (Apéndice A)

TÉCNICA

1 inocular asépticamente cada uno de los tubos de cada juego, con el respectivo microorganismo.
Rotular adecuadamente los tubos.

Incubar a 37°C por 24-48 horas.

Después de éste periodo, observar las reacciones que se efectúan en los medios de fermentación.

Interpretación:

* La utilización del sustrato se ve demostrada por la fermentación del carbohidrato, lo cual se sabe si el indicador vira de color rojo al amarillo.
* Observar si ademas, hubo también turbidez y producción de gas, demostrable por la acumulación de éste en la campana Durham.

Anotar resultados y sacar conclusiones.

“CAPACIDAD ENZIMATICA DE LAS BACTERIAS”

La acción de degradación de un organismo sobre una proteína intacta es analoga al tipo de acción sobre los carbohidratos.
En el caso del almidón, la enzima amilasa degrada al polisacarido en unidades de glucosa que la célula absorbe con facilidad.
En el caso de una proteína, por ejemplo la gelatina, la enzima gelatinasa logra mas o menoslos mismos resultados y produce unidades simples o sea, los aminoacidos.
Como se mencionó antes, el aspecto primordial del metabolismo es la generación y el transporte de electrones, liberando la energía requerida para dicho metabolismo.
Una faceta de este sistema de transporte de electrones es la capacidad de reducir los nitratos a nitritos.
La enzima que permite esta reacción es la NITRATO REDUCTASA.
Muchas bacterias pueden sintetizar aminoacidos a partir de subproductos del metabolismo de carbohidratos y lípidos, cuando disponen de amoníaco como fuente de nitrógeno.
Algunos de estos microorganismos pueden romper el compuesto de urea, por reacción de la enzima UREASA, en amoníaco y dióxido de carbono.
Éste último se incorpora al metabolismo de carbohidratos y nitrógeno a través de diversas reacciones importantes.

MATERIAL Y SUSTANCIAS

- 2 tubos con caldo nitrato
- 2 tubos con caldo urea, con indicador
- 2 cajas Petri conteniendo agar almidón
- 2 cajas Petri conteniendo agar gelatina
- Solución de yodo (lugol)
- Acido Tricloroacético al 5%
- Acido Sulfanílico
- Solución de dimetil-alfa-naftalina
- Zinc en polvo
- 4 tubos de ensayo estériles
- Gradilla
- Pipetas estériles de 1 mL
- Mechero Bunsen
- Cerillos o encendedor
- Asa bacteriológica
- Espatula

TÉCNICA

A. HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

1.- Con un lapiz graso, marcar 2 sectores en la base de la placa de agar almidón y usar un sector para cada organismo.
Inocular en forma de una solo estría a partir de cada cultivo en su sector correspondiente.
Incubar a 37C durante 48 horas.
Después de éste período cubrir con cuidado la superficie de la caja con la solución de yodo.
Buscar zonas transparentes o claras alrededor de las colonias bacterianas en donde se haya digerido al almidón y anotar las conclusiones.

B. METABOLISMO DEL NITRÓGENO

1 Inocularasépticamente los medios que contengan agar gelatina, caldo nitrato y caldo urea con cada uno de los cultivos bacterianos.
Incubar a 37°C por 24 horas.
Después de la incubación, determinar los resultados como sigue:

HIDRÓLISIS DE LA GELATINA

a) Cubrir la superficie de la placa de agar gelatina con 2 mL de la solución de acido tricloroacético.
b) La actividad de la gelatinasa se indica por medio de zonas transparentes alrededor de las colonias.
c) La nebulosidad del medio se debe a la gelatina precipitada.
d) Anotar las conclusiones.

ACTIVIDAD DE LA NITRATO REDUCTASA

a) Extraer 2 ml de caldo de nitrato y colocarlos en un tubo de ensayo estéril.
b) Añadir una gota del reactivo acido sulfanílico y una gota de p-dimetil alfanaftilamina.
c) Hacer observaciones.

Interpretación

Una coloración rojiza o café, es resultado positivo, es decir, existe nitrito.
Si no se desarrolla color, el resultado es negativo. Esto indica la ausencia de nitrito y puede significar que el nitrato no se ha reducido o que se han reducido el nitrato y el nitrito
Para precisar bien que el nitrato no se ha reducido puede seguirse el siguiente procedimiento:
* Extraer 2 mL de cultivo y colocarlos en un segundo tubo de ensayo estéril.
* Añadir una pequeña cantidad de polvo de zinc y el nitrato reaccionara.
* Si se produce un color rojo, el Zinc ha reducido el nitrato al nitrito.
Esto indica que el nitrato se encontraba presente y que no fue reducido por acción bacteriana
* Si no se produce color rojo, esto indica que las bacterias han reducido a los nitratos y a los nitritos, lo cual equivale a una prueba Nitrato Reductasa.
* Anotar conclusiones.

ACTIVIDAD DE LA UREASA

a) Una coloración roja o rojo cereza en el caldo de urea equivale a una prueba positiva (hidrólisis de la urea)
Esta coloración se debe a un indicador de pH en el medio, lo cualdemuestra la presencia de amoníaco (pH 8.1 o mas alcalino)
b) Anotar las conclusiones

“OTRAS REACCIONES BIOQUÍMICAS USANDO MEDIOS DE ENSAYO”

MATERIAL Y SUSTANCIAS

- Cultivos puros
- 2 tubos de ensayo conteniendo medio S.I.M.
- 2 tubos de ensayo conteniendo medio T.S.I.
- 2 tubos de ensayo conteniendo medio MR-VP.
- 2 tubos de ensayo conteniendo medio de SIMMONS.
- Asa bacteriológica
- Mechero Bunsen
- Cerillos o encendedor
- Reactivo de Kovacs
- Reactivo de Voges Proskauer
- KOH al 40%

TÉCNICAS

T.S.I. (AGAR-TRIPLE AZÚCAR-HIERRO

El agar T.S.I. tiene un color rojo naranja en su totalidad (inclinado).
Sembrar por picadura en el fondo y luego en estría al retirar el asa.
Incubar a 37°C durante 18-24 horas.
Observar resultados

a) Si la lactosa es fermentada: Hay producción de acido-color amarillo-, en el fondo y en la superficie y producción de gas en la línea de inclinación y en el fondo.
b) Si la sacarosa es fermentada: Hay producción de acido-color amarillo-, en la línea y en el fondo.
c) Si la glucosa es fermentada: Hay producción de acido-color amarillo-, en el fondo solamente, la superficie permanece alcalina (roja), aunque mas roja que el medio no inoculado.
d) Si ningún azúcar es fermentado: El fondo permanece rojo naranja – como el medio no inoculado -, y la superficie de un rojo un poco mas oscuro. Debe observarse con cuidado para no confundir como fermentación de la glucosa.
e) Si hay producción de gas durante la fermentación de cualquiera de los azúcares: Hay formación de burbujas con quebraduras en el fondo del agar.
f) Si se produce sulfuro: Se observa ennegrecimiento del medio en el fondo o debajo de la superficie del agar, debido a la fermentación del FeS.

S.I.M.

Se emplea para la determinación de producción de sulfuro, formación de indol y movilidad de bacilos entéricos.
Inocular porpicadura en el centro.
Incubar a 37°C durante 18-24 horas o un tiempo mayor.
Observar resultados:
a) Formación de sulfuros: Se determina por el ennegrecimiento del medio a lo largo de la línea de inoculación.
b) Producción de indol: El alto contenido de tripticasa ayuda a observar la producción de Indol, agregando el reactivo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldehido en HCl y alcohol amílico), formara una coloración bugambilia.
c) Movilidad: se determina por el crecimiento lejos de la línea de inoculación.

SIMMONS

Se utiliza Agar citratado para diferencia las bacterias entéricas Gram negativas basandose en la utilidad del citrato como única fuente de carbono.
Puede utilizarse de la misma manera el citrato de Koser para hacer la prueba.
Inocular por estría en tubo inclinado.
Incubar a 37°C por 24 horas.
Observar resultados.
La reacción es positiva si hay un cambio en el color verde del medio al azul (alcalino), del indicador o si se observa desarrollo aun cuando no haya éste vire.
Si se utiliza medio de Koser (líquido), la prueba sera positiva si la bacteria crece y enturbia el medio.

MR-VP
Tubo con caldo glucosado. Ase utiliza para observar la reacción Rojo de Metilo y la de Voges Proskauer (Producción de acetil-metil-carbinol).
Inocular el medio en la forma usual.
2.- Incubar a 37 °C por 24 horas
3.- Después de éste período efectuar las siguientes reacciones:

VOGES PROSKAUER

A 1 ml de cultivo agregar el reactivo de Voges Proskauer: 0.6 mL de alfanaftol al 5% en alcohol etílico absoluto, agregar 0.2 mL de KOH al 40% conteniendo 0.3% de creatina, agitar fuertemente y deja reposar por 5-10 minutos.
La prueba positiva da un color rojo-naranja fuerte que aparece en la superficie y poco a poco se extiende por todo el tubo.

ROJO DE METILO

Al resto del cultivo agregarle una gota de Rojo de Metilo. Si el pH delmedio baja por el metabolismo bacteriano sobre la glucosa, es menor de un pH de 4.5, el indicador se toma rojo y se dice que la prueba del Rojo de Metilo es positiva.
Si el pH del medio es por arriba del pH de 4.5, el color que toma el medio al agregarle el indicador es amarillo y entonces la prueba es negativa.

ANALISIS DE RESULTADOS
- Muestras originales
M1 M3

Después de Incubación:

M1 M3

CARACTERIZACIÓN:

M1 M3
- Tipo de microorganismos Aerobio Aerobio facultativo
con respecto al Co2 (desarrollo en (Desarrollo en todo
superficie) el tubo con burbujas
en el fondo)

PRUEBA DE CARBOHIDRATOS:

- Carbohidratos 2:
M1 M3

MEDIO GAS/ACIDEZ GAS/ACIDEZ

D-Sorbitol -/- +/+

Dextrosa -/- +/+

Galactosa -/- +/+

L-Arabinosa -/- +/+

Lactosa -/- +/+

Maltosa +/- +/+

Manitol -/- +/+

Raffinosa-/- +/-

Sacarosa -/- +/-

Xilosa -/- +/+

PRUEBAS:

M1 M3

Act. Nit. Reductasa -------- ----- ------ ----- ----- --------- ----- ------
Negativo Negativo

Después de agregar Zn Positivo Positivo

MR-VP -------- ----- ------ -------- ----- ------ ------------

Rojo Metil Negativo Positivo
Voges Proskauer Negativo Positivo

Urea -------- ----- ------ -------- ----- ------ ----- ----- -----
Negativo Negativo



SIM -------- ----- ------ -------- ----- ------ ----- ----- -----

Movilidad Móvil Móvil
Prueba Indol Producción de Indol No producción de Indol
Formación de sulfuros No No

SIMMONS -------- ----- ------ -------- ----- ------ -------- ----
Negativa Negativa

TSI -------- ----- ------ -------- ----- ------ ----- ----- ------


CONCLUSIONES

En conclusión, gracias a las pruebas hechas de TSI, SIMMONS, SIM, de UREA, MR – VP, entre otras, se pudo confirmar la existencia de los microorganismos aerobios con sus diferentes características obteniendo resultados sobre cada prueba, mas no pude hacer la clasificación de cada una de las bacterias.

CUESTIONARIO

1 Elaborar un cuadro contodos los resultados de las distintas pruebas.

CARACTERIZACIÓN:

M1 M3
- Tipo de microorganismos Aerobio Aerobio facultativo
con respecto al Co2 (desarrollo en (Desarrollo en todo
superficie) el tubo con burbujas
en el fondo)

PRUEBA DE CARBOHIDRATOS:

- Carbohidratos 2:
M1 M3

MEDIO GAS/ACIDEZ GAS/ACIDEZ

D-Sorbitol -/- +/+

Dextrosa -/- +/+

Galactosa -/- +/+

L-Arabinosa -/- +/+

Lactosa -/- +/+

Maltosa +/- +/+

Manitol -/- +/+

Raffinosa -/- +/-

Sacarosa -/- +/-

Xilosa -/- +/+

PRUEBAS:

M1 M3

Act. Nit. Reductasa -------- ----- ------ ----- ----- --------- ----- ------
Negativo Negativo

Después de agregar Zn Positivo PositivoMR-VP -------- ----- ------ -------- ----- ------ ------------

Rojo Metil Negativo Positivo
Voges Proskauer Negativo Positivo

Urea -------- ----- ------ -------- ----- ------ ----- ----- -----
Negativo Negativo



SIM -------- ----- ------ -------- ----- ------ ----- ----- -----

Movilidad Móvil Móvil
Prueba Indol Producción de Indol No producción de Indol
Formación de sulfuros No No

SIMMONS -------- ----- ------ -------- ----- ------ -------- ----
Negativa Negativa

TSI -------- ----- ------ -------- ----- ------ ----- ----- ------

2.- Comparar los resultados anteriores con la tabla de reacciones bioquímicas que se les proporcionara y clasificar las bacterias problema.

Hacer dibujos de las observaciones hechas.

Consultar la reacción del desdoblamiento de la urea por acción de la enzima ureasa.

H2N
C=O + 2 HOH CO2 + H2O + 2 NH3
H2N
UREA

5 Consultar la reacción del desdoblamiento del Triptofano para la producción de Indol.

BIBLIOGRAFÍA

1 https://es.scribd.com/doc/14778249/7/REACCION-DE-LA-UREASA “Reacción de la Ureasa”
Fecha de consulta: 22/10/2011

2.https://bibliotecadigital.ilce.edu.mx/sites/ciencia/volumen1/ciencia2/43/html/sec_6.html “Metabolismo bacteriano”
Fecha de consulta: 21/10/2011

3.- https://erikaquiceno.blogspot.com/2009/10/metabolismo-bacteriano_17.html “El metabolismo bacteriano”
Fecha de consulta: 21/10/2011