INDICE
PRECENTACION
RECOMENDACIONES
bacterias
que es una bacteria
clasificación de bacterias
PRACTICA # 1
Preparación y esterilización de materiales de medio de cultivo.
Preparación del material de vidrio y medios de
cultivo.
Esterilización de materiales y medios de cultivo.
Preparación de las cajas de Petri y tubos con medio de cultivo.
Prueba de esterilidad de materiales.
2
PRESENTACION
La Microbiología, es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la biología. El estudio de los
microorganismos se inicio a partir de que Antonie van Leeuwenhoek en 1670
invento el microscopio, y que apartir de los estudios de Luis Pasteur en 1876,
se logro el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como
actores de una gran diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de
enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde
la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos
de producción de alimentos fermentados como queso, vino, pan y cerveza,
entre otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas
areas de investigación basica, en la industria alimentaria,
ambiental y farmacéutica.
El objetivo general de este manual de cultivo de bacterias es que aprenda los
conocimientos de la biología basica de los microorganismos, en
sus características morfológicas, nutricionales de crecimiento,
control y que adquiera las habilidades necesarias para su manipulación
en el laboratorio.Este manual esta dirigido a estudiantes que iniciaran su
experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo que considero de gran
importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones
relacionadas con las reglas generales del laboratorio y de los principales
procedimientos que el estudiante debera de aprender, para que manipule
en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la
de sus compañeros.
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
Reglas de laboratorio
Durante las sesiones, siempre debera usar una
bata de laboratorio bien abotonada, que debera quitarse antes de
abandonar el laboratorio.
No debera sacar del laboratorio ningún
equipo, medios o cultivos microbianos.
Evitara la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no
relacionados con la practica de laboratorio. Colocara todos
los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el
profesor.
Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida
dentro del
laboratorio.
Se prohíbe fumar, aplicar cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se
debera lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de
salir del
laboratorio, incluyendo cuando salgan por breves momentos.
Por seguridad no debera pipetear oralmente ningún tipo de cultivo
microbianos, esta actividad debera realizarse con pipetas accionadas de
forma mecanica o automatica, tratando de evitar la
formación de aerosoles.
No se admitiran visitas personales que distraigan la atención y
pongan en riesgo laseguridad en el trabajo que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
Antes y después de cada sesión practica los alumnos
deberan limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se le
proporcionara para este fin.
Cuando se utilice el mechero, este debera
colocarse alejado del microscopio y otros
equipos así como
de sus cuadernos y otras prendas de vestir.
Al concluir cada sesión el estudiante debera asegurarse de que
los materiales se desecho u objetos contaminados sean
colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares
apropiados, que les indicara el profesor.
Siempre debera dejar perfectamente todos los equipos utilizados
(microscopio, balanzas analíticas, autoclave, potenciometros, etc.) y
reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
En caso de producirse un incendio o una herida
personal, el alumno debera notificarlo de inmediato al profesor. En caso
de derrame de cultivo o rotura de recipientes con cultivos activos,
debera conservar la calma y ademas de informar al profesor, seguir
inmediato el procedimiento
Colocar las toallas de papel sobre el material derramado para evitar su
dispersión
Poner abundante solución desinfectante sobre la toallas
Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarla en el
receptaculo destinado a la eliminación de materiales
contaminados.
Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio
Bata de laboratorio limpia y con botones
el protocolo de la practica y bitacora de laboratorio
un pedazo de tela sin pelusa, cerillos,tijeras, cinta de enmarcar, marcador
permanente o etiquetas pequeñas.
BACTERIAS
¿QUE ES UNA BACTERIA? Las bacterias son microorganismos unicelulares
que presentan un tamaño de algunos micrómetros de largo (entre 0 y 5 μm, por lo general) y diversas formas incluyendo
cocos(esferas), basilos(barras) y espirilos (hélices). Las bacterias son procariotas y, por lo tanto, a diferencia de las
células eucariotas (de animales, plantas, etc.), no tienen el nucleo
definido y presenta organulos internos de locomoción.
Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de
desplazamiento y son móviles. Del estudio de las bacterias se encarga la
bacteriología, una rama de la
microbiología.
Las bacterias son los organismos mas abundantes del planeta. Son
ubicuas, se encuentran en todos los habitats terrestres; crecen hasta en
los mas extremos como
en los manantiales de aguas calientes y acidas, en desechos
radioactivos, en las profundidades tanto del
mar y como de
la corteza terrestre. Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las
condiciones extremas del espacio exterior. Se estima
que se pueden encontrar en torno a 40 millones de células bacterianas en
un gramo de tierra y un millón de
células bacterianas en un mililitro de agua dulce. En
total, se calcula que hay aproximadamente 5×1030 bacterias en el mundo.
Las bacterias son imprescindibles para el reciclaje de los
elementos, pues muchos pasos importantes de los ciclos biogeoquímicos
dependen de éstas. Como ejemplo cabe
citar la fijacióndel nitrógeno atmosférico. Sin
embargo, solamente la mitad de los filos conocidos de bacterias tienen especies
que se pueden cultivar en el laboratorio, por lo que una gran parte (se supone
que cerca del
90%) de las especies de bacterias existentes todavía no ha sido
descrita.
En el cuerpo humano hay aproximadamente diez veces tantas células bacterianas
como
células humanas, con una gran cantidad de bacterias en la piel y en el
tracto digestivo. Aunque el efecto protector del sistema inmune
hace que la gran mayoría de estas bacterias sea inofensiva o
beneficiosa, algunas bacterias patógenas pueden causar enfermedades
infecciosas, incluyendo cólera, sífilis, lepra, tifus, difteria,
escarlatina, etc. Las enfermedades bacterianas mortales
mas comunes son las infecciones respiratorias, con una mortalidad
sólo para la tuberculosis de cerca de dos millones de personas al
año.
En todo el mundo se utilizan antibióticos para tratar
las infecciones bacterianas. Los antibióticos son efectivos
contra las bacterias ya que inhiben la formación de la pared celular o
detienen otros procesos de su ciclo de vida. También se usan
extensamente en la agricultura y la ganadería en ausencia de enfermedad,
lo que ocasiona que se esté generalizando la resistencia de las
bacterias a los antibióticos. En la industria, las bacterias son
importantes en procesos tales como el tratamiento de aguas
residuales, en la producción de queso, yogur, mantequilla, vinagre,
etc., y en la fabricación de medicamentos y de otros productos
químicos.
Aunque el término bacteria incluíatradicionalmente a todos los
procariotas, actualmente la taxonomía y la nomenclatura
científica los divide en dos grupos. Estos dominios
evolutivos se denominan Bacteria y Archaea (arqueas). La división
se justifica en las grandes diferencias que presentan ambos grupos a nivel
bioquímico y en aspectos estructurales.
CLASIFICACION DE BACTERIAS
Cocos: forma esférica u ovalada
Estreptococos (en cadena).
Diplococos (dobles).
Estafilococos (en racimos).
Bacilos: en forma de bastón.
Espirilos: en forma de espiral.
Vibrios: en forma de coma.
· Estructura de las bacterias
-Capsula: no es constante, es una capa gelatinosa de tamaño y
composición variable formada de polisacaridos.
-Pared celular: es rígida, dúctil y elastica. Su
originalidad reside en la naturaleza química del compuesto
macromolecular que le confiere su rigidez. Formada por
peptiglucal y acido teitoico.
-Membrana celular: semejante a la membrana celular, es una envoltura que rodea
al citoplasma.
-Citoplasma: masa de materia viva donde se encuentran los ribosomas (que
intervienen en la fabricación de proteínas) y granos de grasa o
de glúcidos que le sirven de almacén. En las
bacterias autótrofas se encuentran cromatóforos, donde se
almacena la clorofila.
-Plasmidio: formado por DNA, de forma circular.
-Flagelos: no existen mas que en ciertas especies. Filamentosos
y de longitud variable, constituyen los órganos de locomoción.
Según las especies, pueden estar implantados en uno o
en los dos polos de la bacteria o en todo su entorno. Constituyen el
soporte de los antígenos 'H'.En algunos bacilos Gram negativos
se encuentran Pili, que son apéndices mas pequeños que los
cilios y que tienen un papel fundamental en
genética bacteriana.
-Pili: estructura que sirve de adherencia a la superficie. Sirve
de puente citoplasmatico entre la transferencia de información
genética.
-Ribosomas: son granulos y se componen generalmente de RNA.
-Mesosoma: repliegue de la membrana celular, tiene gran importancia en la
división celular y la reparación de la célula.
Las paredes de las células de las bacterias pueden ser
Gram positivas: tienen una pared gruesa, es decir mas capas. Se tiñen
con tinsón yoduro yodurado. Tiene capa gruesa de peptidoglical y
acido teitoico
Gram negativas: tienen una pared delgada, una capa. No se tiñen con
yoduro yodurado sino con suframina. Tienen una capa de
peptidoglical y por fuera una membrana externa.
· Reproducción de la bacteria
Generalmente las bacterias se reproducen por bipartición, como se ve en
el siguiente esquema
Tras la duplicación del ADN, que esta dirigida por la ADN-polimerasa
que se encuentra en los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un
tabique transversal separador de las dos nuevas bacterias.
Pero ademas de este tipo de reproducción
asexual, las bacterias poseen unos mecanismos de reproducción sexual o
parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos de ADN.
Puede realizarse por
Transformación: Consiste en el intercambio genético producido
cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que
se encuentran dispersos enel medio donde vive.
Transducción: En este caso la transferencia de
ADN de una bacteria a otra, se realiza a través de un virus
bacteriófago, que se comporta como
un vector intermediario entre las dos bacterias.
Conjugación: en este proceso, una bacteria
donadora F+ transmite a través de un puente o pili, un fragmento de DNA,
a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plasmidio, ademas del cromosoma bacteriano.
· Bacterias patógenas
Casi 200 especies de bacterias son patógenas para el ser humano, es
decir, causantes de enfermedades. El efecto patógeno varía mucho
en función de las especies y depende tanto de la virulencia de la
especie en particular como
de las condiciones del
organismo huésped.
Los efectos patógenos provocados por las bacterias en los tejidos pueden
agruparse en las cuatro clases siguientes
1.- efectos provocados por la acción directa local de la bacteria sobre
los tejidos, como
en la gangrena gaseosa causada por Clostridium perfringens.
efectos mecanicos, como cuando un grupo de bacterias bloquea un
vaso sanguíneo y causa un émbolo infeccioso.
efectos de respuesta del
organismo ante ciertas infecciones bacterianas en los tejidos, como
las cavidades formadas en los pulmones en la tuberculosis, o la destrucción
de tejido en el corazón por los propios anticuerpos del organismo en las fiebres
reumaticas.
efectos provocados por toxinas producidas por las
bacterias, sustancias químicas que resultan tóxicas en algunos
tejidos. Las toxinas son, en general, específicas de cada especie;
porejemplo, la toxina responsable de la difteria es diferente de la responsable
del
cólera.
· Bacterias resistentes
La aparición de bacterias con resistencia a antibióticos y
otras drogas antimicrobianas fue, es y probablemente seguira siendo uno
de los grandes problemas de la medicina. Su causa es el mecanismo mas
basico de la evolución de los seres vivos: la mutación
espontanea y la recombinación de los genes durante
la reproducción, que al crear variabilidad permite que actúe la
selección natural. Esto favorece el desarrollo de las
variantes que mejor se adaptan al ambiente. Cuando las bacterias se
desarrollan en medios que contiene una droga antibacteriana, sólo
creceran aquellas que por mutación adquirieron genes que confieren
resistencia;
mientras que no lo haran las que son sensibles a la droga. Este caso de
selección natural hace que con el correr del tiempo todas
las bacterias sean resistentes a la droga.
Entre los factores que favorecen la selección y la diseminación
de genes que confieren resistencia,
cabe mencionar
· El uso indiscriminado de las drogas antibacterianas.
· La exposición de las bacterias a otros
agentes capaces de seleccionar variedades resistentes. Un
ejemplo es la exposición al mercurio, presente en algunos
desinfectantes.
· El aumento en la población de pacientes cuyo sistema inmune se
encuentra deprimido (enfermos de SIDA, pacientes que han
recibido transplantes de órganos y pacientes sometidos a tratamientos
contra el cancer). Estas condiciones favorecen la aparición de
infecciones, llamadas oportunistas, que debenser tratadas mediante el
suministro prolongado y en dosis altas de drogas
antibacterianas.
· El uso de antibióticos en la
alimentación de animales.
· El desarrollo de los medios de transporte que permite la rapida
diseminación de cepas resistentes.
Uno de los hechos que preocupan es que, a pesar del esfuerzo de los
científicos, se esta tornando cada vez mas difícil
encontrar nuevos antibióticos. Por ejemplo, las penicilinas ya han llegado a la sexta generación, las
cefalosporinas, a la cuarta y las quinolonas, a la tercera. Mientras tanto
estan apareciendo cepas de bacterias causantes de enfermedades
infecciosas que se consideraban ya dominadas, las cuales adquirieron resistencia
a las drogas mas indicadas para combatirlas.
SEGUN SU GRAM
La tinción de Gram es un tipo de tinción
empleado en microbiología para la visualización de las bacterias,
debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que
desarrolló un método de tinción en 1884.
Por mas de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la
reacción de Gram, la habilidad de retener un complejo de iodo violeta
cuando se trata con con un solvente organico tal como el alcohol o la acetona , las bacterias Gram positivas retienen la tintura y
aparecen de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener
y se tiñen de color rojo para ser vistas con el microscopio, como se
muestra a continuación.
Preparación y esterilización de materiales
y medio de cultivo
Objetivos
Conocer los principios generales de las técnicas de
esterilización de los materiales de vidrioy medios de cultivo en uso común en el laboratorio. Observar
el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la
contaminación microbiana en el lab.
Introducción
Los microorganismos como
otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones ambientales y
en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido
en una gran diversidad de habitats incluyendo los de condiciones
extremas sobre todo de tipo físico y químico.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de
desinfección y esterilización para limitar su presencia o
eliminarlos. La esterilización es un
método de eliminación total de todo tipo de organismos y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la
desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetales de los
microorganismos.
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos
de mayor utilización en Microbiologia. El calor seco desnaturaliza las
enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo al
ponerlos directamente a la flama de un mechero o en
horno a150-180ºC durante 2 horas. Estos métodos
se aplican principalmente en la esterilización de asas de inoculador y
todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de
cultivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el mas recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor
de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121ºC. El material
se deja a esta temperatura durante 15 minutos
paraasegurarse de la destrucción de endoesporas, que son las estructuras
bacterianas mas resistentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como
las soluciones de vitaminas, aminoacidos, etc. se esterilizan por
filtración en membranas estériles de 0,2 micras de
diametro y para el caso de materiales de plastico es recomendable
el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies
generales se desinfectan son radiaciones U.V. O compuestos químicos en
forma liquida como:
los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio, formaldehido, alcoholes,
halogenos y detergentes.
Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de filtración son muy eficientes y
rapidos para la esterilización pero solo se aplican en
pequeños volúmenes. Los fenoles y compuestos
cuaternarios de amonio son muy efectivos para la desinfección de
superficies pero son muy corrosivos. Los detergentes y los alcoholes
tienen actividad limitada contra esporas bacterianas y algunos virus por lo que
solo son desinfectantes.
Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita
9 cajas de Petri de vidrio
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10 mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitación
1 autoclave
1 ponteciometro
1 horno de calor seco
1 mechero Fisher
1 incubadora a 35º
1 isotopo estéril, algodón y gasa
papel manila o estraza para envolver
