ASPECTOS BIOQUÍMICOS DE LA FITOHEMAGLUTININA. APLICACIONES EN TERAPÉUTICA MÉDICA

INTRODUCCIÓN.

Desde hace algún tiempo existe la certeza, al menos teórica, de que algunos mitógenos derivados de plantas podrían actuar sobre el sistema inmunológico modulando su respuesta (Wimer, 1996, 1998). Estos mitógenos pertenecen a las lectinas, una clase de proteínas bastante heterogéneas en cuanto estructura cuaternaria, que poseen como rasgos comunes la capacidad para unirse específica y reversiblemente a determinados carbohidratos y la posibilidad de aglutinar células. Algunas pueden ser agrupadas en familias sobre la base de determinadas características. Así aparecen, por ejemplo, las lectinas de las legumbres o los cereales, estructuralmente bastante parecidas a las lectinas tipo C (Ca2+ dependientes) de los animales y que contienen dominios homólogos de reconocimiento a carbohidratos (Sharon, 1993).

Dentro de las fitolectinas o lectinas de las legumbres o los cereales, que como familia muchas de ellas comparten también la propiedad de inducir mitosis en algunos tipos de células; se encuentra la lectina de la semilla del guisante, la lectina de la lenteja, la aglutinina del frijol de soya, la aglutinina del germen del trigo, el mitógeno de la hierba carmín, la aglutinina del maní, la concanavalina A y la fitohemaglutinina (PHA, siglas en inglés), entre otras (Sharon, Lis & Lotan, 1974). De todas ellas una de las mas estudiadas y una de las que mayor interés despierta en investigaciones es la fitohemaglutinina por la amplia gama de aplicaciones que se le atribuyen.

FITOHEMAGLUTININA. PROPIEDADES BIOLÓGICAS. CARACTERÍSTICAS ESTRUCTURALES.

La PHA integra lafracción proteica de las semillas del frijol colorado común Phaseolus vulgaris, aglutina tanto hematíes como leucocitos, se une a determinados oligosacaridos y estimula la mitosis en diferentes estirpes celulares, dentro de ellas los linfocitos (Hamelryck et al, 1996). Es la lectina mas abundante en estas semillas, donde alcanza entre el 5 y el 10% del contenido proteico total (Staswick & Chrispeels, 1984) y comprende cinco glicoproteínas tetraméricas (isolectinas) (PM=115000±4130 D, por ultracentrifugación), muy estables sobre todo en medio acido (Biswas & Kayastha, 2004) y formadas por dos polipéptidos (L=leucocito y E=hematíe) (Leavitt, Felsted & Bachur, 1977) en las combinaciones (L4, L3E1, L2E2, L1E3, E4) (Hamelryck et al, 1996). Las subunidades E (PM=31700±600 D) son responsables de la eritroaglutinación, pero muestran poca o ninguna actividad mitogénica, mientras que las subunidades L (PM=29900±200 D) confieren propiedades leucoaglutinantes a la proteína nativa y tienen la maxima actividad estimulante de la mitosis (Felsted, Leavitt, Chen & Bachur, 1981; Monsigny, Jeune-Chung & Perrodon, 1978).

Las dos subunidades difieren en la secuencia de aminoacidos desde el residuo 1 al 7, pero son idénticas en las posiciones 8 a la 24. Los residuos 12 y 60 de cada subunidad son una asparagina glicosilada con igual composición en. Los últimos tres residuos de las subunidades son también semejantes (Millar, Hsu, Heinrikson & Yachnin, 1975).

Las isolectinas tienen una composición aminoacídica muy semejante; sólo difieren en los aminoacidos treonina, lisina y arginina y carecen de aminoacidos azufrados (Leavitt et al, 1977). Los oligosacaridos presentes en la proteína tienen unalto contenido de manosa (4 %) y N-acetil-D-glucosamina (2,2 %) (digestión con α -manosidasa y endo-β -N-acetilglucosaminidasa H). Aparecen también otros carbohidratos como fucosa y xilosa (Staswick & Chrispeels, 1984; Vitale, Ceriotti, Bollini & Chrispeels, 1984).

En todas las lectinas derivadas de plantas existen dos iones metalicos por monómero (un ión Ca2+ y un ión de un metal de transición, fundamentalmente Mn2+) situados en la vecindad del sitio de unión a los carbohidratos. La PHA posee estos mismos iones y su presencia es esencial tanto para la unión a los carbohidratos como para la mitogenicidad de la proteína. Los dos iones metalicos estan ligados por cuatro moléculas de agua y seis residuos de aminoacidos (una histidina, un glutamico, una asparagina, dos aspartico y un residuo hidrofóbico) (Hamelryck et al, 1996).

Ademas del sitio de unión a los carbohidratos, un grupo de lectinas, dentro de ellas también la PHA, poseen sitios hidrofóbicos de unión, que pueden ser divididos en tres grupos. El primero esta adyacente al sitio de unión a los carbohidratos y es el responsable de la afinidad 10 veces mayor de estas lectinas por los monosacaridos que contienen sustituyentes hidrofóbicos, que por aquellos que no los poseen. El segundo, situado a una distancia aproximada de 30 Å del sitio de unión a los azúcares, tiene una baja afinidad por los ligandos hidrofóbicos. Y el tercero es un sitio de alta afinidad por la adenina y sus derivados N-6 (incluidas un número de hormonas derivadas de adenina, presentes en las plantas) (Hamelryck et al, 1996).

LOCALIZACIÓN Y FUNCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA EN LA PLANTA.

La PHA se acumula, sobre todo, en lasvacuolas de almacenamiento del parénquima de los cotiledones de las semillas, pero también se concentra en las raíces de la planta, específicamente en las vacuolas de los meristemas de las raíces primarias y en las paredes celulares de las raíces elongadas. Mediante PCR reversotranscriptasa se ha demostrado la existencia casi exclusiva de ARNm de la isoforma PHA-E en estos últimos sitios (Chrispeels, 1995).

Se presume que la PHA junto con la arcelina y el inhibidor de la α amilasa participa en mecanismos de defensa en la planta. Estas últimas dos proteínas son consideradas formas truncadas de la PHA en las cuales se han perdido, una y dos de las vueltas o lazos necesarios para unirse a carbohidratos, respectivamente, aboliendo de ellas esta propiedad (Hamelryck et al, 1996; Mirkov et al, 1994).

La PHA actúa protegiendo las semillas contra virus, bacterias, hongos y herbívoros invertebrados, papel determinado en gran medida, por la capacidad de reconocer y unirse a glicanos extraños a la planta (Peumans & Damme, 1995; Rudiger, 1998).

GENÉTICA Y BIOSÍNTESIS DE LA FITOHEMAGLUTININA.

Las subunidades E y L son miembros de una familia de cuatro polipéptidos codificados por igual número de genes estrechamente relacionados y a los que se hace referencia como familia de la PHA del frijol. Esta familia, ademas de la PHA-E y la PHA-L, también contiene a la arcelina y al inhibidor de la α amilasa (Hamelryck et al, 1996).

Durante el desarrollo de las semillas, no todas las variedades de Phaseolus vulgaris, sintetizan PHA en la misma proporción. Se han encontrado reducidos niveles de ARNm para PHA en aquellas plantas que producen la proteína en menor medida (Staswick &Chrispeels, 1984). Se responsabiliza de este hecho a la presencia de codones de terminación prematuros que desestabilizan el ARNm. Estos ARNms desestabilizados son reconocidos y rapidamente degradados como mecanismo que le evita a la planta la producción de moléculas de proteína truncadas, hipo o afuncionales. La desestabilización es dependiente de la posición de los codones sin sentido. Hay indicios de que los transcriptos con codones sin sentido situados en aproximadamente el 20, el 40 ó el 60 % de la secuencia a lo largo de la región codificante normal, producen ARNms altamente inestables, mientras que un transcripto con un codón sin sentido al 80 % es tan estable como el tipo salvaje (van Hoof & Green, 1996).

En la biosíntesis los glicopéptidos sufren modificaciones tanto cotraduccionales como postraduccionales. Los polipéptidos se sintetizan mediante polisomas unidos al retículo endoplasmico. La glicosilación va sucediendo al mismo tiempo de la traducción y en este proceso cada cadena polipeptídica adquiere las dos cadenas laterales de oligosacaridos. La de la posición asparagina 12 tiene un alto contenido de manosa, mientras que la de la asparagina 60 contiene mucho menos manosa pero adicionalmente posee fucosa y xilosa (Faye, Sturm, Bollini, Vitale & Chrispeels, 1986).

El transporte de la proteína hacia las vacuolas de almacenamiento es mediado por el aparato de Golgi, donde al menos una porción de las cadenas de oligosacaridos sufre modificaciones. Estas modificaciones producen un gradual acortamiento de las cadenas de carbohidratos hasta alcanzar el pequeño tamaño que tienen cuando ya las glicoproteínas estan en las vacuolas (Vitale et al, 1984).

Se hallegado a la conclusión de que las dos cadenas de carbohidratos adicionadas a los residuos 12 y 60 tienen un alto contenido de manosa cuando son recién sintetizadas; pero la unida a la posición 60 es la que sufre fundamentalmente las transformaciones, lo cual puede deberse a que las enzimas responsables de este proceso tienen un mayor acceso a esta cadena que a la de la posición 12 (Faye et al, 1986). La importancia biológica de este procesamiento no esta muy clara, aunque sí se conoce que no esta relacionado con las señales que marcan a la molécula como una proteína vacuolar, sino que tal información esta contenida en el dominio polipeptídico de la proteína (Voelker, Herman & Chrispeels, 1989), entre los residuos 14 y 23 de la PHA madura, mas específicamente cerca de la posición 19. No se descarta la posibilidad de un segundo dominio que puede funcionar conjuntamente con el primero para un correcto marcaje de la proteína (Tague, Dickinson & Chrispeels, 1990).

BASES ESTRUCTURALES DEL RECONOCIMIENTO E INTERACCIÓN DE LA FITOHEMAGLUTININA CON LOS CARBOHIDRATOS.

La gran mayoría de las propiedades biológicas de las lectinas estudiadas hasta el momento se basan en la capacidad para reconocer e interactuar con diferentes carbohidratos (Sharma & Surolia, 1997). La especificidad para estas moléculas varía ampliamente entre las diferentes lectinas (Sharma & Surolia), condicionado por la variabilidad estructural de los sitios de unión (Sharon, 1993), donde las interacciones hidrofóbicas, las modificaciones postraduccionales y la oligomerización juegan un papel esencial (Vijayan & Chandra, 1999). Los analisis extensivos de las secuencias y estructuras de varias lectinasmuestran que a pesar de la hipervariabilidad de sus regiones de combinación ellas exhiben un significativo patrón de uniformidad (Sharma & Surolia) y la especificidad por los diferentes monosacaridos parece depender de un núcleo conservado de residuos que forma puentes de hidrógeno con el azúcar y una vuelta o lazo variable que determina la forma exacta del sitio de unión. La alta afinidad por oligosacaridos y monosacaridos particulares que contienen sustituyentes hidrofóbicos resulta fundamentalmente de la existencia de distintos subsitios próximos al sitio de unión a los carbohidratos; subsitios que tienen un pequeño número de residuos y se encuentran tanto en sitios específicos para manosa como para galactosa (Loris, Hamelryck, Bouckert & Wyns, 1998).

Específicamente para la PHA-L, el cambio de la asparagina de la posición 128 por acido aspartico, elimina completamente la capacidad de unión a los carbohidratos y con ello las actividades leucoaglutinantes y mitogénicas características. Esta mutación, sin embargo, no impide que los polipéptidos formen los tetrameros normales y sean transportados hacia las vacuolas de almacenamiento de la célula (Mirkov & Chrispeels, 1993). El determinante estructural mínimo, altamente afín para la PHA-L es el pentasacarido Gal β 1→ 4 GlcNAc β 1→ 2 [Gal β 1→ 4 GlcNAc β 1→ 6] Man (Hamelryck et al, 1996).

APLICACIONES PRACTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA.

Dadas las propiedades de aglutinar células sanguíneas, la PHA se utilizó inicialmente como medio para separarlas de la sangre total (Li & Osgood, 1949). Al demostrarse posteriormente el efecto mitogénico, el espectro de aplicaciones se incrementó y actualmente se usa como factorestimulante de la proliferación en cultivos de diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos (Buhring et al, 1999; Fukao et al, 1999; Kenan et al, 1992); en los que también actúa sobre los procesos bioquímicos relacionados con la respuesta inmune (Kawashima, Kawasaki, Kitamura Tnojima & Morimoto, 1998; Kunikata et al, 1998; Ohbo et al, 1995; Ryan, Vadas & Shannon, 1994). Otras aplicaciones incluyen el estudio in vitro de los mecanismos bioquímicos de la apoptosis (Posmantur, Wang & Gilbertsen, 1998; Wakamatsu, Makino, Tei & Baba, 1999) y de la proliferación celular en linfocitos (Emamghoreishi et al, 1997; Forcic & Mazuran, 1999; Jensen, Odum, Jorgensen, Christophersen & Olesen, 1999), su empleo como marcador histoquímico en estudios de neurofisiología, neuroanatomía y en el proceso de envejecimiento del SNC (Lanciego, Mengual, Erro & Gimenez-Amaya, 1999; Wouterlood & Groenewegen, 1991), como marcador farmacológico para el seguimiento de la respuesta al tratamiento y toxicidad de medicamentos (Stein
Murray & Word, 1999) y en la producción y mejora de medios diagnósticos y métodos analíticos (Delves, 2001; Hampel, Kottgen, Dudenhausen & Kottgen, 1999; Ijima, Kimura & Shiba, 1999). Todas estas aplicaciones se basan esencialmente en la propiedad de combinarse específicamente con determinados sacaridos.

POTENCIALIDADES TERAPÉUTICAS DE LA FITOHEMAGLUTININA.

Los resultados in vitro avalan el posible uso terapéutico de la PHA, sobre todo de la isoforma mitogénica L4. Se reconoce en esta proteína a un ideal modificador de la respuestas biológicas a causa de su extensivo estudio, su disponibilidad en forma pura y estable, convenientemente administrable por múltiplesvías, aparentemente no sensibilizante, poco tóxica, con maxima efectividad a dosis relativamente bajas, no inductora de estrés, no oncogénica, no infecciosa, compatible con otras modalidades terapéuticas, probablemente compatible con el embarazo y con una adecuada relación costo-efectividad (Wimer, 1990).

La inmunoterapia sería uno de los campos mas beneficiados con su uso debido a la capacidad de interacción rapida e irreversible con los linfocitos, uno de los principales efectores de la respuesta inmune (Wimer, 1990). Su potencial terapéutico también podría incluir areas como la oncología, las infecciones críticas, los transplantes, las quemaduras extensivas, las aplasias medulares e incluso, ser utilizada como agente adyuvante en la producción de vacunas, pues ha resultado mas efectiva de esta manera que como agente de inducción (Wimer, 1990, 2002).

EFECTO INMUNOMODULADOR DE LA FITOHEMAGLUTININA.

La evaluación de las posibilidades de la PHA como modulador del sistema inmune ha estado comprometida debido al empleo de excesivas dosis de PHA eritroaglutinante, nocivas para el sistema circulatorio de los pequeños animales de laboratorio; mientras que en humanos el factor limitante ha sido la restringida disponibilidad del mitógeno en forma no aglutinante. Como consecuencia, la subestimación de su eficacia ha conspirado contra la producción industrial de las cantidades adecuadas para ensayos clínicos. No obstante, se han empleado los datos experimentales que existen para pronosticar a priori los efectos de la modulación mitogénica in vivo (Wimer, 1996).

La transformación linfocítica (blastogénesis) fue descrita por vez primera por Nowell en 1960. Usando PHApara separar las fracciones sanguíneas por aglutinación de glóbulos rojos y blancos, este autor observó que la PHA también estimulaba los linfocitos a una transformación tipo blastocito y división celular. Esta observación se aplicó rapidamente al estudio de los cromosomas humanos y se usó para medir el potencial de proliferación de los linfocitos, propiedad esencial para la inmunidad mediada por células. Se considera que la estimulación no específica y no inmunológica por la PHA, hace que del 65 al 90 % de los linfocitos presentes en el cultivo experimenten blastogénesis y división celular después de 2-3 días en cultivo (Cohen, 1983).

La mayoría de las observaciones apoyan la tesis de que la estimulación ocurre fundamentalmente sobre los linfocitos T (Bohnlein et al, 1989; Cohen, Ichikawa, Lavastida, Gonzalez & Daniela, 1983; Hernandez & Leavitt, 1984; Wimer, 1997), otros plantean que las poblaciones de linfocitos B también son estimuladas a proliferar y diferenciarse, aunque en menor proporción (Shankey, Daniele & Novell, 1981). Utsinger et al. (1977) encontraron incrementos en el contenido de ADN entre aproximadamente el 4 y el 8 % de las células B altamente purificadas, mientras que Knuutila y Kovanen (1987), hallaron una frecuencia de mitosis entre el 6 y el 20 % en estas células. No obstante, se considera que la proliferación y diferenciación de los linfocitos B necesita, en última instancia, de la presencia de subpoblaciones de linfocitos T auxiliadores que serían inducidos por la PHA (Clement, Dagg, Lehmeyer & Kiyotaki, 1983).

Otro aspecto relacionado con la acción inmunomoduladora de la PHA y que tendría un fuerte impacto en terapéutica es la tambiénseñalada posibilidad de suprimir la capacidad de respuesta del sistema inmune. Aunque no esta muy claro aún el mecanismo por el cual se produce la inmunosupresión, ya desde los años 70s se plantea como posibilidad el hecho de que la PHA fuese capaz de activar células supresoras que secundariamente podrían inhibir la proliferación linfocitaria (Kurnick, Bell & Grey, 1976). También se señala como probable el hecho de que los linfocitos estimulados podrían liberar productos solubles capaces de activar las células supresoras y de esta manera inducir la inmunosupresión (Larsson & Blomgren, 1978;Mawas, Charmot, Comoy & Sasportes, 1977).

Sobre este tópico Wimer (1998) señala que ademas del efecto supresor inherente, esta sustancia también potencia la supresión generada por los agentes convencionales, tanto a nivel de la respuesta inmune celular como de la humoral. Borrebaeck y Schon (1987) en su estudio con diferentes líneas de células T de leucemia linfocítica humana, encontraron inhibición de la proliferación y la síntesis de ADN. Estos autores emplearon PHA-L y PHA-E y observaron que el grado de inhibición era dependiente de la dosis de la isolectina y que se necesitaban concentraciones considerablemente mayores (hasta 10 veces mas) de la isolectina E que la necesaria para inducir la misma respuesta con la PHA-L.

POSIBLES BENEFICIOS DEL USO DE LA FITOHEMAGLUTININA EN ALGUNAS AFECCIONES ESPECÍFICAS.


Wimer es uno de los autores que mas ha especulado sobre el posible uso de la PHA en terapéutica, tomando como base, principalmente, los hallazgos experimentales de otros investigadores. Según su parecer hay tres enfermedades que pueden recibir los supuestosbeneficios de la PHA directamente: la anemia aplastica, el cancer y la infección por VIH (Wimer, 1990, 1997, 1998, 2000, 2002).

En la anemia aplastica el mitógeno podría ser utilizado en tres formas diferentes: (1) En los tipos de anemias por citotoxicidad directa mas benignos, se podría aplicar un régimen estimulante para incrementar la producción de factores de crecimiento y de esta manera acelerar la recuperación de la aplasia, (2) Donde es necesario un aloinjerto de células madres hematopoyéticas para reemplazar la médula ósea severamente dañada, se podría incluir el mitógeno en el régimen preparatorio, (3) En las anemias aplasticas de causa inmunológica en las que es necesario instaurar un protocolo de supresión, la PHA adicionada a un régimen de drogas como la ciclosporina y la globulina antilinfocito, podría, no sólo incrementar la supresión, sino también prevenir la reemergencia tardía del desorden clonal (Wimer, 1998).

En el tratamiento del cancer, la PHA podría ser efectiva por la posibilidad de ayudar a la inducción de la remisión en ciertos tumores, por tener un efecto citotóxico antitumoral directo, por mejorar el efecto antineoplasico de las radiaciones y la quimioterapia, por disminuir el riesgo de transformación maligna, por promover la diferenciación y restaurar la respuesta de crecimiento normal en las células malignas, por manifestar un riesgo mínimo de suprimir la actividad citotóxica antitumoral, así como por amplificar la inmunogenicidad de las células tumorales (Wimer, 1990).

En la infección por VIH, administrada sistematicamente, la PHA podría interferir con la invasión del virus a las células CD4+ al bloquear las moléculas de la glicoproteína120 en la cubierta viral necesarias para este proceso; al mismo tiempo que activaría los linfocitos T como consecuencia de su unión a las proteínas CD2 y al receptor de los linfocitos T para antígenos. La naturaleza no específica de las células efectoras antivirales generadas por esta activación, impediría las mutaciones a la vez que se recuperarían las células T depletadas, se estimularía la mielopoyesis y se reforzaría la resistencia a las malignizaciones y las infecciones prevalentes en el estado de inmunodeficiencia. Estos efectos adecuadamente coordinados con una apropiada combinación de inhibidores de la proteasa y la reversotranscriptasa, podrían teóricamente, acelerar la completa eliminación del VIH, acortando así la duración del tratamiento requerido y eliminando los perjudiciales efectos de las mutaciones del virus en estos pacientes (Wimer, 1998, 2000, 2002).

RESUMEN

Se obtuvieron preparaciones crudas de fitohemaglutinina (PHA) a partir de frijol colorado (Phaseolus vulgaris) por 2 métodos: extracción acuosa y extracción acida. Por el método acido se obtuvieron mejores resultados en cuanto a concentración de proteínas y pureza de la misma. Se empleó la cromatografía en hidroxiapatita para separar las isoformas que forman la PHA y se obtuvieron 5 fraccciones proteicas que se evaluaron funcionalmente junto con las preparaciones crudas, a través de sus propiedades eritroaglutinantes y leucoaglutinantes. A medida que se aumentó la fuerza iónica del medio se observó que las fracciones obtenidas presentaban una disminución relativa de la actividad leucoaglutinante, así como un incremento relativo de la actividad eritroaglutinante. Las preparaciones crudas ylas fracciones se evaluaron electroforéticamente y se obtuvieron bandas muy similares a la de la PHA patrón utilizada.

Descriptores DeCS: FITOHEMAGLUTININAS.

La fitohemaglutinina (PHA) se obtiene a partir de diferentes variedades de frijol pertenecientes a la especie Phaseolus vulgaris. Es una proteína que presenta una potente actividad mitogénica que también es capaz de aglutinar distintos tipos de células, tales como eritrocitos y leucocitos.1-3

La PHA esta constituida por una mezcla de 5 isolectinas tetramétricas (L4, L3E, L2E2, LE3 y E4) con propiedades biológicas diferentes, las cuales estan formadas por varias combinaciones de 2 subunidades L y E. La isolectina L4 tiene una actividad mitogénica y leucoaglutinante potente, sin embargo, no presenta actividad eritroaglutinante, mientras que la E4 tiene actividad eritroaglutinante muy fuerte pero no muestra actividad leucoaglutinante. Las isolectinas restantes, L3E2 y LE3, presentan actividad leucoaglutinante y eritroaglutinante proporcionales a las cantidades de subunidades E y L.4,5

El objetivo de este trabajo es la obtención de preparados de PHA a partir del frijol colorado mediante 2 métodos diferentes de extracción, así como el estudio preliminar de la separación y evaluación biológica de sus isoformas.

MÉTODOS

Se utilizó frijol colorado (variedad 'Cueto') de alta calidad suministrado por INIFAT. Se emplearon 2 métodos de extracción en paralelo para obtener la fitohemaglutinina mezcla (PHA-M).

Método 1: extracción acuosa y precipitación salina.6
Se tomaron 100 g de harina de frijol y se sometieron a extracción en frío en 500 mL de agua destilada. Luego se realizó una precipitación acida conacido clorhídrico (HCl) 5 M hasta pH = 4,6 y se centrifugó a 3 000 rev/min durante 30 min a 4 °C.

Al sobrenadante se le reajustó el pH hasta la neutralidad y se realizó una precipitación salina con (NH4) 2SO4 al 60 %.

Método 2: combinación de extracción acida con 2 precipitaciones salinas (Laboratorio Central de la Defensa Civil: Informe Técnico sobre Método de Obtención de Fitohemaglutinina, 1996).

Se tomaron 100 g de harina de frijol y se realizó una extracción en frío en 100 mL de HCl 0,1 N. Posteriormente se centrifugó a 3 000 rev/min durante 30 min a 4 °C y al sobrenadante obtenido se le realizó una precipitación salina fraccionada con (NH4) 2SO4 al 15 y 80 %, respectivamente.

En ambos métodos el precipitado final se resuspendió en agua destilada y se dializó contra la misma en una relación 1/5. El producto final se clarificó en un equipo de filtración Sartorius.

La concentración de proteínas se determinó por el método de Macart, con la utilización del reactivo azul de Coomassie.7

La separación de las isoformas se realizó empleando una columna 10 cm de hidroxiapatita (CENIC),8 en la que se aplicaron 10 mL del extracto de PHA-M equilibrado con solución amortiguadora de fosfato (Na2HPO4, 0,005 M/NaCl 0,1 M; pH = 6,8). Para la elución de las fracciones se empleó un flujo continuo de 0,5 mL/min con un gradiente discontinuo de fuerza iónica creciente de solución amortiguadora de fosfato. Cada fracción se monitoreó a 280 nm con un registrador acoplado a un cromatógrafo líquido (FPLC). Se concentró por ultrafiltración en AMICON 8050 (membrana YM-30). La concentración de proteínas totales se determinó antes y después de la ultrafiltración.

Laevaluación electroforética se realizó en geles de poliacrilamida con SDS a la PHA-M, a la PHA-M patrón y a las 5 fracciones obtenidas por cromatografía en hidroxiapatita. Se empleó una PHA-M patrón comercial de la DIFCO de 1 mg/mL de concentración y colorante Coomassie blue R-250 como revelador.

La actividad biológica de las muestras se evaluó a través de su actividad leucoaglutinante y eritroaglutinante. Esta última se estudia mediante diluciones seriadas de eritrocitos O Rh D positivo al 2 %, incubados a temperatura ambiente durante 1 h. Se observó la reacción de aglutinación macro y microscópicamente según la técnica de Rigas y Osgood.6

Los leucocitos de sangre periférica se aislaron por un gradiente Ficoll-Hypaque (d = 1,077 g/mL). La actividad leucoaglutinante se clasificó de acuerdo con el método de Lenier y otros.9

 
RESULTADOS

En la tabla 1 se presenta el comportamiento de las proteínas totales extraídas por los 2 métodos empleados y los estadígrafos media y desviación estandar para ambos métodos; mientras que en la tabla 2 se muestran los valores de concentración de proteínas y proteínas totales tanto de ambos extractos, como de las fracciones correspondientes a los picos cromatograficos.

TABLA 1. Valores de proteínas totales correspondientes a cada método de extracción
|  |Valores de proteínas totales (mg) |
|Experimento |Método 1 |Método 2 |
|1 |510,5 |1 022 |
|2|500,0 |1 025 |
|3 |508,4 |1 065 |
|4 |500,0 |1 035 |
|5 |502,0 |1 055 |
|  |504,1 ± 4,85 |1 040,4 ± 18,86 |

Media ± desviación estandar.
TABLA 2. Valores de concentración de proteínas y proteínas totales de la PHA-M de ambos métodos y de las fracciones correspondientes

 
|  |Volumen  |Concentración de  |Proteínas |
|Muestra  |(mL)  |proteínas (mg/mL)  |totales (mg) |
|Fracción 1 |9,00 |0,57 |5,13 |
|Fracción 1' |7,00 |0,48 |3,47 |
|Fracción 2 |13,60 |4,24 |57,70 |
|Fracción 3 |21,00 |0,93 |19,53 |
|Fracción 4 |11,50 |0,59 |6,78 |
|PHA-M1 |10,00|10,53 |3,50 |
|Fracción 1 |10,70 |0,71 |7,60 |
|Fracción 1' |11,00 |0,67 |7,37 |
|Fracción 2 |12,50 |4,86 |60,75 |
|Fracción 3 |19,90 |0,68 |13,53 |
|Fracción 4 |12,50 |0,74 |9,25 |
|PHA-M2 |10,00 |10,40 |104,00 |

 
Los resultados electroforéticos de la PHA-M, así como de las fracciones obtenidas por ambos métodos, muestran una banda entre los 125 y 138 KD que coincide con la de la proteína intacta (patrón de la DIFCO). En el caso de la PHA-M obtenida por el método 1 se presenta otra banda en los 96 KD, que no esta presente en la PHA-M obtenida por el método 2.

Las fracciones cromatograficas obtenidas a partir de la PHA-M procedentes de los métodos 1 y 2 presentan bandas electroforéticas entre 30 y 33 KD correspondientes con el peso molecular de las subunidades de la PHA.10

La actividad eritroaglutinante de la PHA-M en ambos métodos coincide con la PHA-M patrón (1/512), las fracciones 1,1'y 2 no presentaron actividad, mientras que las fracciones 3 y 4 presentaron eritroaglutinante de 1/256 en los 2 métodos analizados (tabla 3).

TABLA 3. Actividaderitroaglutinadora de la PHA-M y sus fracciones correspondientes obtenidas por los métodos de extracción 1 y 2

|  |Diluciones dobles de las muestras vs. eritrocitos al 2 % |
|Muestra  |Puro |
|PHA-M patrón |1+ |
|PHA-M1 |1+ |
|Pico 1 |2+ |
|Pico 1' |3+ |
|Pico 2 |2+ |
|Pico 3 |1+ |
|Pico 4 |+/- |
|PHA-M2 |1+ |
|Pico 1 |2+ |
|Pico 1' |3+ |
|Pico 2 |2+|
|Pico 3 |1+ |
|Pico 4 |+/- |

DISCUSIÓN

Los valores que se observan en la tabla 1 evidencian que el método de extracción 2 posee un rendimiento en proteínas totales de casi el doble que el método 1, por lo que es mas efectivo para la extracción de esta proteína.

Desde el punto de vista de la composición cualitativa de las isolectinas, no parece que haya diferencia entre ambos métodos, por la similitud que presentan los cromatogramas de los extractos. En ellos se obtuvieron 4 picos como informó Lagomasino (obtención de la PHA-L a partir de PHA-M mediante hidroxiapatita. Informe Técnico 85-IL-03 del Departamento de Bioquímica del Instituto de Nefrología, 1985: 3-11). El pico 1 en ambos casos presenta un hombro en la parte interior (que denominamos pico 1'), lo que indica la presencia de otra proteína que eluye con un tiempo de retención casi idéntico que el primero, por lo cual se colectaron de forma independiente para su estudio (fracción 1 de 1').

Leavitt y otros10 comunicaron 5 picos correspondientes a 5 isolectinas obtenidas por medio de una combinación de cromatografía de afinidad con intercambio iónico. A nuestro juicio, una modificación en el sistema de elución inicial en la cromatografía empleada nos permitira obtener una mejor separación de las fracciones 1 y 1'.

La cantidad de proteínas totales (tabla 2) del conjunto de fracciones obtenidas es ligeramente superior para el método 2, lo queresulta ser una consecuencia de la mayor extracción obtenida por éste.

La ausencia de la banda electroforética en los 96 KD para la PHA-M obtenida por el método 2 en relación con el método 1, se debe probablemente a que el método 2 incluye una precipitación previa que puede eliminar otras proteínas contaminantes.

Los resultados obtenidos en cuanto a la actividad eritroaglutinante y leuco-aglutinante en ambos métodos indican que las fracciones 1 y 1' contienen las mayores concentraciones de las subunidades isofórmicas L, mientras que las 3 y 4 contienen las mayores concentraciones de E, lo que esta de acuerdo con los datos publicados por otros autores.11 No obstante, se debe modificar el sistema de elución utilizado en la cromatografía en hidroxiapatita, con el objetivo de mejorar la resolución en la separación de las fracciones 1 y 1'.

La PHA-M obtenida a partir de los 2 métodos empleados resultó adecuada para ser utilizada en el estudio de las isoformas de la fitohemaglutinina, sin embargo, el método de extracción 2 fue superior al 1 en cuanto a rendimiento en proteínas totales y pureza de la PHA-mezcla obtenida, por lo que desde el punto de vista practico es mas conveniente utilizar el método de extracción 2 para el estudio de las isoformas de la fitohemaglutinina.

CONCLUSIONES

Son evidentes las potencialidades de la PHA y su aplicación en terapéutica médica, avaladas por sus bien documentadas propiedades biológicas y una vasta utilización en estudios in vitro. Esto, unido a la posibilidad de su empleo en el tratamiento de enfermedades, hasta el momento incurables, como el SIDA y el cancer, justificaría cualquier esfuerzo de la ciencia en investigacionesin vivo en este campo.

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