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Purificación de la lizosima - informe de laboratorio, estudiantes de profesional en criminalistica del tecnologico de antioquia




INFORME DE LABORATORIO
ESTUDIANTES DE PROFESIONAL EN CRIMINALISTICA DEL TECNOLOGICO DE ANTIOQUIA



INTRODUCCION
“es una enzima de 14,4 kilodalton que daña las células bacterianas catalizando la hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de acido N-acetilmuramico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano.” Es una enzima hidrolasa que actua sobre bacterias gram positivas(Micrococcus lysodeikticus) destruyendo su pared bacteriana en el huevo es extraida para uso comercial del control bacteriano en los vinos, sirve como enzima catalitica la lisozima hace que las células fagocíticas puedan absorber mas facilmente a la bacteria. Para su extraccion se le cambia el punto isoelectrico con el tampon A (glicina/NaOH 100mM, pH 10)solo una proteina tiene carga negative, la resina se adhiere luego se centrifuga y debido a este movimiento se precipita el material mas pesado y el menospesado queda en el sobrenadante y luego hay que seperar la resina de la lisozima



Ref: Blake CC, Koenig DF, Mair GA, North AC, Phillips DC, Sarma VR. Structure of hen egg-white lysozyme. A three-dimensional Fourier synthesis at 2 Ångstrom resolution. Nature, 206, 757-61


MATERIALES Y METODOS
Todos los materiales fueron otorgados por la institucion univeristaria Teconologico de Antioquia la cual nos brindo:
-Huevo de Gallina para la obtención de la enzima
-Tampon A: glicina/NaHO100mM,pH10
-Carboximetil-Celulosa
-Sulfato de Cuprico (CuSO4) Reactivo de Biuret
-Tubo Cónico
-Probetas
-“pHmeter simpHony SP70P”
-2 pipetas de 10ml
-2 beacker
-1 indular de Ref:004
Se tomo una muestra de 1ml de clara de huevo la cual fue vertida en una probeta y diluida con 4ml de tampon A, se dejo reposar por 4.42s consiguiente a esto se le virtio 5ml de tampon A. En dicha probeta de este se extrajo una muestra de 1ml y se virtio en un tubo conico con Tampon A, en el mismo tubo se virtieron 5ml de resina activada con un ph de 13.0 el cual fue registrado por PHmeter simPHony “sp70p” este se sacudio durante 15min, al cumplirse este tiempo se uso un indular Ref.004 para centrifugar la muestra durante un lapso de 3 minutos con una velocidad de 600 rpm (revoluciones por minuto) consiguiente a esto hubo una presipitacion de la clara de huevo, se tomaron 6ml con 14 gotas de NaOH (hidróxido sódico) y 7 gotas de CuSO4 en un tubo conico de Tampon A, lo siguiente a esto fue que observamos una coloracion violeta en el sobrenadante con lo que se da a demostrar la presencia en la clara de huevo, quedando en el precipitado la lizosima y la resina la cual no tuvimos tiempo de separar.





Proteinas de la clara de huevo: Aproximadamente, el huevo contiene unos 6 gramos de proteínas, 3,6 de los cuales, provienen de la clara del huevo. Ademas de las proteínas, encontramos otros nutrientes en la clara del huevo, como por ejemplo, riboflavina, niacina, acido fólico, vitamina B12, calcio, hierro, cobre, zinc y sodio.De las 72 calorías que tiene el huevo, tan sólo 17 pertenecen a la clara.
Tampón: Los organismos vivos soportan muy mal las variaciones del pH, aunque tan solo se trate de unas décimas de unidad, y por ello han desarrollado en la historia de la evolución sistemas tampón o buffer que mantienen el pH constante, mediante mecanismos homeostaticos. Las variaciones de pH, afectan a la estabilidad de las proteínas y, en concreto, en la actividad catalítica de los enzimas, pues en función del pH, pueden generar cargas eléctricas que modifiquen su actividad biológica.
Glicina: Es el aminoacido mas pequeño que existe, ya que no posee rama lateral. Forma parte de la estructura de las proteínas, ademas de funcionar como neuro transmisores en combinación con la glutamina teniendo un papel importante en la función cerebral.
https://www.ecured.cu/index.php/Glicina
Carboximetil-celulosa: es un polímero aniónico soluble en agua. Este éter celulósico se produce haciendo reaccionar alcalicelulosa con monocloroacetato de sodio bajo estrictas condiciones de proceso. En la reacción se obtienen como subproductos cloruro de sodio y glicolato de sodio, estas sales son posteriormente removidas obteniéndose la CARBOXIMETILCELULOSA DE SODIO altamente purificada.
Reactivo de biuret: El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (de NaOH o KOH), una molécula formada a partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la mas sencilla que da positiva esta reacción
La presencia de proteínas en una mezcla.https://catedras.quimica.unlp.edu.ar/qo3/Apuntes/Biuret.pdf

tubo cónico: tubo utilizado en las ciencias como recipiente con fin de transportar muestras.
Probeta: Tubo de vidrio, con pie, generalmente graduado, que se usa en los laboratorios para medir líquidos o gases.
https://es.thefreedictionary.com/probeta
Pipetas: Tubo de cristal alargado y estrecho que se usa en los laboratorios para medir volumen y trasladar pequeñas cantidades de líquido de un recipiente a otro; esta graduado y puede ser mas ancho por la parte central.
https://es.thefreedictionary.com/pipeta
Beaker: recipiente de vidrio transparente, con forma cilíndrica y boca ancha. Tiene una escala de graduación impresas con líneas blancas las cuales indican el volumen de forma ascendente.
Indular: equipo utilizado para centrifugación de muestras.
Probeta: instrumento de laboratorio que se utiliza, sobre todo en analisis químico, para contener o medir volúmenes de líquidos de una forma aproximada. Es un recipiente cilíndrico de vidrio con una base ancha, que generalmente lleva en la parte superior un pico para verter el líquido con mayor facilidad.
Resina: es cualquiera de las sustancias de secreción de las plantas con aspecto y propiedades mas o menos analogas a las de los productos así denominados. Del latín resina. Se puede considerar como resina las sustancias que sufren un proceso de polimerización o secado dando lugar a productos sólidos siendo en primer lugar líquidas.
Sobrenadante: es la fase líquida superior que aparece cuando secentrifugadora la muestra, de modo que cuando se saca de la centrífuga queda el sobrenadante arriba y el precipitado o pellet en el fondo.



Riboflavina: También conocida como vitamina B2; es una vitamina hidrosoluble de color amarillo, constituida por un anillo de isoaloxazina dimetilado al que se une el ribitol, un alcohol derivado de la ribosa. Los tres anillos forman la isoaloxacina y el ribitol es la cadena de 5 carbonos en la parte superior.


Niacina: También conocida como vitamina B3, acido nicotínico y Vitamina PP; es un compuesto organico y uno de los entre cuarenta a ochenta nutrientes esenciales de humanos.
Acido fólico: conocida también como vitamina B9, es una vitamina hidrosoluble del complejo de vitaminas B, necesaria para la formación de proteínas estructurales y hemoglobina (y por esto, transitivamente, de los glóbulos rojos); su insuficiencia en los humanos es muy rara.
vitamina B12: La cianocobalamina o vitamina B12 es un complejo hexacoordinado de cobalto. Cuatro posiciones de coordinación estan ocupadas por un macrociclo de corrina. Una de las posiciones axiales se completa con un grupo cianuro.
Calcio: El calcio es el elemento químico con el símbolo Ca y número atómico 20. Calcio es un metal alcalinotérreo gris suave y es el quinto mas abundante elemento en masa en la corteza terrestre. El calcio, con una densidad de 1.55 g/cm3, es el mas ligero de los metales alcalinotérreos
Hierro: Este metal es el cuarto elemento mas abundante en la corteza terrestre, representando un 5% y, entrelos metales, sólo el aluminio es mas abundante. El núcleo de la tierra esta formado principalmente por hierro y níquel, generando al moverse un campo magnético. Ha sido históricamente muy importante, y un período de la historia recibe el nombre de edad de Hierro. En cosmología, es un metal muy especial, pues es el metal mas pesado que puede producir la fusión en el núcleo de estrellas masivas; los elementos mas pesados que el hierro solo pueden crearse en supernovas.
Cobre: Se trata de un metal de transición de color rojizo y, se caracteriza por ser uno de los mejores conductores de electricidad.
El cobre posee un importante papel biológico en el proceso de fotosíntesis de las plantas, aunque no forma parte de la composición de la clorofila. El cobre contribuye a la formación de glóbulos rojos y al mantenimiento de los vasos sanguíneos, nervios, sistema inmunitario y huesos y por tanto es un oligoelemento esencial para la vida humana.
El cobre se encuentra en una gran cantidad de alimentos habituales de la dieta, el desequilibrio de cobre ocasiona en el organismo una enfermedad hepatica conocida como enfermedad de Wilson.
Zinc: El zinc es un mineral esencial para nuestro organismo.
Nuestro organismo contiene de 2 a 3 gramos de zinc.
Mas del 85 % del total se deposita en los músculos, huesos, testículos, cabello, uñas y tejidos pigmentados del ojo.
Se requiere de 2 a 10 miligramos diarios y se encuentra
en productos de mar, carnes y lacteos, aunque también
en frutos secos y cereales fortificados.Sodio: Es un metal alcalino blando, untuoso, de color plateado, muy abundante en la naturaleza. Es muy reactivo, arde con llama amarilla, se oxida en presencia de oxígeno y reacciona violentamente con el agua.

















RESULTADOS
Purificación de la lisozima
El fin del laboratorio era obtener separado la resina del huevo y la enzima lisozima el cual no se logro ya que llegamos al primer centrifugado y no pudimos separar la lisozima de la resina de huevo.
1. Se diluyo 1/5 de clara de huevo con tampón A. tomamos 10 ml de la muestra anterior en un tubo icónico, retiramos 1ml.
2. Antes de comenzar la purificación separamos una alícuota para medir la actividad de la enzima en la fracción de partida, como resultado obtuvimos un ph de 13.
3. A los 9 ml restantes, se añadió 4 ml de cm-celulosa previamente activada y se agito durante 15 minutos suavemente, para que la lisozima absorbiera la resina.
4. Pasado los 15 minutos centrifugamos la muestra durante 3 minutos a 600 rpm y como resultado obtuvimos una precipitación y separación de moléculas, y un sobrenadante ( como muestra la figura 1 y 2)

Figuras 1 y 2


5) a la resina (precipitado) se retiro 6 ml, y se le administro 14 gotas de Naoh y 7 gotas de sulfato de cobre en un tubo cónico con tampón, obtuvimos una reacción de coloración en morado, como resultado se demostró la presencia de proteínas en la clara de huevo, quedando en el precipitado las lisozima y la resina. (Como vemos en la figura 3 y 4)

Figuras 3 y 4





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