Practicas:

Observación de Bacterias

Coloración de Gram

Coloración de Esporas de Bacterias

Resumen
En las tres practicas realizadas de coloración, se observaron distintas formas bacterianas; en la coloración simple se realizó tinción con colorantes acidos y basicos sobre las muestras de superficie de la mesa, piel y aire; en la muestra en fresco vimos levaduras y su movimiento, mientras que en las muestras en seco observamos estafilococos, estreptococos y estreptococos respectivamente. En la coloración de gram observamos bacterias gram positivas y bacterias gram negativas, trabajamos con E.coli (gram negativo), B.aereus (gram positivo) y staphylococo (gram positivo), se utilizo cristal violeta, lugol, alcohol acetona y safranina. La coloración de esporas fijamos en la muestra bacilos (B.cereus, B.subtilis), la técnica a usar fue el método de Schaeffer – fulton donde se utilizó verde malaquita y safranina. Las diferentes tinciones son muy importantes para conocer la morfología bacteriana y sus estructuras.

Introducción
Las coloraciones realizadas en el laboratorio a las diferentes bacterias fueron basadas en diferentes técnicas, el primer método fue coloración simple, en el cual se realizo preparación no coloreada, en este método se observan las bacterias vivas y se puede ver facilmente su morfología y su movilidad; la otra forma es preparación coloreada con esta técnica se utilizan algunos colorantes para ver mejor las bacterias ya que como son incoloras y no se pueden ver a simple vista, esta técnica ofrece grandes ventajas como diferenciar losdiferentes tipos morfológicos bacterianos esto se puede apreciar por un contraste entre la bacteria y el medio que la rodea; se puede observar las estructuras internas y externas de la célula. Con estas técnicas se puede observar algunas formas bacterianas como lo son los cocos que son células esféricas que se pueden agrupar en parejas y reciben el nombre de diplococos, en racimos y se les llama estafilococos (como los que se observaron en el laboratorio de la superficie de la mesa), en cadenas y son estreptococos (obtenidos de la piel y del aire en la practica realizada en el laboratorio), de a cuatro y su nombre es tétradas o en cubos y se nombran como sarcinas. Otra forma de las bacterias son los bacilos que son células con forma de bastón que suelen presentarse solas o agrupadas al asar, formando así cadenas o en palizadas. También encontramos las espirales, su forma es helicoidal y generalmente no se agrupan. Los colorantes mas utilizados en la coloración simple son compuestos organicos, una de las características de estos colorantes es la carga de ion coloreado, puede ser un anión o un catión según lo amerite y los colorantes se denominan colorantes acido y colorantes basicos.
La siguiente técnica es la coloración de gram que fue descubierta por el bacteriólogo Christian Gram, donde se dividieron las bacterias en dos grandes grupos, las gram positivas y las gram negativas. Las gram positivas cuentan con una malla de péptidoglicano en su parte mas externa, estas no se decoloran y retiene el color violeta, mientras que las Gram negativas estan recubierta por una fina capa depeptidoglicano y presentan una membrana externa, estas se decoloran reteniendo el color de la safranina.
Finalmente la última técnica de coloración realizada fue la coloración de esporas de bacterias, la formación de esporas es principalmente en los bacilos de los géneros bacillus y clostridium y también se ha encontrado en cocos agrupadas en tétradas del genero esporosarcina. En la coloración de esporas se realizo el método de Schaeffer – fulton ya que como las esporas son tan difícil de colorear es necesario el procedimiento de este método en donde se utiliza verde de malaquita. Todos estos métodos son muy importantes ya que podemos diferenciar las formas de las bacterias y conocemos las enfermedades que producen y en que medios actúan.

Objetivos
1. Conocer el papel que desempeña cada uno de los métodos en las diferentes formas bacterianas
2. Identificar por cada uno de los métodos de coloración las enfermedades que estas producen o los beneficios
3. Diferenciar las diferentes formas de las bacterias y su ambiente.

Marco teórico
1. Coloración simple: en esta técnica un colorante, proporciona contraste para observar mejor un organismo completo
2. Preparación en fresco: las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y su movimiento.
3. Preparación no coloreada: este método se utiliza para observar las bacterias vivas, su morfología y su facilidad de movilidad.
4. Preparación coloreada: esta técnica se utiliza para visualizar mejor las bacterias, ya que estas tienen el mismo índice de refracción del agua esnecesario usar algunos colorantes.
5. Colorantes basicos: son colorantes en los cuales el catión es el coloreado y el anión es el incoloro.
6. Colorantes acidos: son colorantes en los cuales el anión es el coloreado y el catión incoloro.
7. Coloración de Gram: este método distingue dos tipos de bacterias las gram positivas y las gram negativas, las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona. Las bacterias gram positivas no se decoloran y retienen el color.
8. Gram positivas: son las bacterias que no son decoloradas por el alcohol acetona y retienen el color del cristal violeta gracias a su gruesa pared celular
9. Gram negativas: son las bacterias que son decoloradas por el alcohol acetona y su color es rosado
10. Coloración por el método de Schaeffer – fulton: como a las esporas es tan difícil decolorar con los métodos anteriores entonces se utiliza una coloración específica utilizando verde malaquita que es capaz de teñir las esporas en caliente.
11. Verde malaquita: es el colorante utilizado en el método de Schaeffer – fulton y con ayuda del calor le da el color verde a las esporas

Procedimiento experimental
En la practica de observación de bacterias el procedimiento que utilizamos fue: primero preparación no coloreada, donde observamos una preparación en fresco de un medio líquido, se vio el movimiento de las bacterias que eran levaduras. En la preparación coloreada con colorantes basico se utilizo el azul de metileno y bacterias sacadas de cultivos de la superficie de la mesa, de la piel y el aire. En colorantesacidos utilizamos la nigrosina, después fueron observados todos los montajes en el microscopio en 40 x y 100 x, se vieron estafilococos y estreptococos.
En la coloración gram positiva realizamos montajes con estreptococos, estafilococos, bacterias gram positivas y gram negativas, el procedimiento fue el siguiente: cristal violeta, lugol, alcohol acetona y por ultimo safranina, los resultados obtenidos fue E.coli que es gram negativa observada en 100 x, estafilococos es gram positiva, observada en 100 x y por ultimo estreptococos que son gram positivos y se observaron en 100 x.
Por ultimo en coloración de esporas se fijo la muestra de bacillus y se cubrió con verde malaquita hasta cubrir toda la placa y después se calentó, después de lavarse se cubrió con safranina y se observo en el objetivo de 100 x.

Analisis y discusión de resultados
Las coloraciones son muy importantes para la ciencia y específicamente para la microbiología, con los diferentes métodos de coloración aprendimos a conocer diferentes tipos de bacterias y las ventajas y desventajas que nos pueden traer, en la practica de coloración simple, trabajamos con preparación en fresco y no colorada el cual fue levadura, en estas se podía ver el movimiento de las bacterias como lo decía en la teoría y ademas se veía su forma la cual era esférica como cocos; en las muestras en seco se hicieron en preparación coloreada, en estas aprendimos a utilizar los colorantes acidos y basicos, en el colorante basico utilizamos el colorante azul metileno el cual es un catión coloreado, para este colorante cogimos muestras desuperficie de la mesa, piel y aire, comparandolas con la teoría efectivamente pudimos observar las diferentes formas de las bacterias, en la muestra de la superficie de la mesa vimos estafilococos, por que son esféricos y estaban en racimos, en las de la piel vimos estreptococos eran cocos en forma de cadenas y en la muestra del aire observamos también estafilococos. Ademas también se pudo ver contraste de la bacteria con el medio así se pudo diferenciar esta morfología de la que se esta hablando.
En los colorantes acidos se utilizó la nigrosina en la cual se vio bacilos, los cuales tenían forma de bastón, la nigrosina se uso en este método ya que este es un colorante que no tiñe directamente la célula sino el medio que la rodea y así se observo con mas claridad.
En la coloración de gram la cual sirve para diferenciar las bacterias gram positivas de las gram negativas, para esta practica utilizamos estreptococos, estafilococos, bacilos gram positivos y bacilos gram negativos, al realizar el procedimiento agregandole cristal violeta, agua, solución yodada, (lugol), alcohol acetona, safranina y agua pudimos diferenciar con esto las bacterias gram positivas de las gram negativas, en el experimento igual que en la teoría observamos que el alcohol acetona decolora las bacterias gram negativas ya que estas no son capaz de retener el colorante cristal violeta y quedando con un color rosado, mientras que las bacterias gram positivas quedaron con un violeta por el colorante cristal violeta, en nuestra practica los cocos salieron de color violeta o sea que son bacterias grampositivas ya que no perdieron el color, mientras que el E. coli quedo de color rosado, este es un bacilo que es gram negativo ya que fue decolorado.
Por ultimo en las coloraciones realizamos la practica de coloración de esporas en la cual se da en los géneros Bacillus, clostridium y esporosarcina, el método usado fue Schaeffer – fulton en el cual el colorante utilizado fue verde malaquita principal colorante para las esporas ademas se uso el calor complemento de este colorante para teñir las esporas que son tan difíciles de teñir ya que son muy resistentes, se lavo la placa y se le agrego safranina, el resultado que obtuvimos fue el esperado ya que las esporas se vieron de color verde obviamente era el bacilo cereus, en el cual se vieron las esporas muy claras y bonitas.
Conclusiones
1. Las tinciones nos permite el estudio de las estructuras internas y externas de la célula bacteriana, tales como paredes celulares, cuerpos celulares, capsulas y flagelos. También se diferencia las formas bacterianas como los cocos, bacilos y espirales.
2. Las técnicas nos ayudan a distinguir las bacterias por tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.
3. Las coloraciones son muy importantes por que podemos diferenciar las diferentes formas de las bacterias como lo son los cocos, los bacilos y las espirales.
4. Las tinciones nos permiten diferenciar el tipo de bacteria y por ende la enfermedad que esta causa en un ambiente determinado, ayudandonos así a ser mas prevenido en cuanto el ambiente enel que trabajamos y vivimos.

Consultas
Coloración Gram

* ¿Por qué es mas difícil decolorar una célula gram positiva?
Porque las células gram positivas tienen una pared celular mas gruesa que las gram negativas, las positivas poseen una malla de péptido glicano en su parte mas externa.
* Tres ejemplos de bacterias gram positivas y tres ejemplos de bacterias gram negativas y enfermedades
En bacterias gram positivas podemos encontrar algunos ejemplos y algunas enfermedades unas de ellas son:
1. Bacteria Erysipelothrix rhusiopathiae: esta bacteria crece principalmente en un medio con materia muerta, las personas se infectan casi siempre por una herida profunda mientras manipulan materia animal se produce una infección cutanea llamada erisipelotricosis
2. Bacteria Listeria monocitogenes: esta bacteria puede afectar a cualquier órgano del cuerpo humano, por lo general se contrae consumiendo productos lacteos contaminados o verduras crudas. La enfermedad que produce esta bacteria se conoce como listeriosis.
3. Bacteria Bacillus anthracis: esta bacteria infecta la piel, los pulmones y el aparato gastrointestinal, la enfermedad que produce esta bacteria se llama antrax y es una enfermedad muy contagiosa y mortal.
Ejemplos de bacterias gram negativas y enfermedades que estas producen
1. Bacteria Bartonella henselae: esta bacteria es causada por producto de arañazo de un gato, la infección suele ser en el punto del arañazo, la enfermedad es llamada arañazo de gato.
2. Bacteria Vibrio cholerae: esta bacteria afecta principalmente alintestino delgado, la enfermedad causada por esta bacteria es la cólera.
3. Bacteria pseudomonas aeruginosa: esta bacteria es la principal causa de dos infecciones frecuentes, que pueden afectar a las personas normales y sanas: el oído del nadador y la foliculitis de la bañera. La enfermedad es llamada infecciones por Pseudomonas.

* ¿cuales son las diferencias entre bacterias gram positivas y bacterias gram negativas?
La pared celular de las bacterias gram positivas es mas gruesa que la pared celular de las células gram negativas que es mas delgada; las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante-mordiente y las bacterias Gram negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante-mordiente. Las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminoacidos que la gram-negativa; el contenido graso es mucho mas elevado en la gram-negativa que en las gram-positivas.
* Tres ejemplos de antibióticos para bacterias gram positivas y tres ejemplos para bacterias gram negativas y sobre que actúan
Ejemplos de antibióticos para bacterias gram positivas
1. Penicilina: para bacterias gram positiva, bloquean la infección en la enfermedad de erisipelotricosis.
2. Tobramicina: para bacterias gram positiva, tratan las valvulas cardiacas en la enfermedad de listeriosis.
3. Tetraciclinas: para bacterias gram positiva, esta trata el antrax cutaneo en la enfermedad del antrax
Ejemplos de antibióticos para bacterias gram negativas
1.Ciprofloxacina, tetraciclinas o la eritromicina: para bacterias gram negativas, eliminan las bacterias Campylobacter y curan la diarrea en la enfermedad llamada Infecciones por Campylobacter, esta es una infección del aparato gastrointestinal o de la sangre, causada por esta bacteria.
2. Tetraciclina: para bacterias gram negativas, elimina las bacterias y suele detener la diarrea en 48 horas en la enfermedad conocida como cólera.
3. Trimetoprim-sulfametoxazol, Norfloxacina, Ciprofloxacina y Furazolidona: para bacterias gram negativas, estos antibióticos reducen la gravedad de los síntomas y el tiempo que las heces contengan la bacteria Shigella en la enfermedad aonocida como la shigelosis que es una infección intestinal que produce diarrea intensa.

Coloración de esporas

* ¿Por qué las esporas no se pueden colorear con otras técnicas como el gram?
Las esporas son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, entre otros, es por eso que se hacen impermeables a las tinciones.
* ¿Por qué las esporas resisten el calor en el método schaeffer – fulton?
Las esporas son resistentes a procesos que matan normalmente a las células vegetativas. Las endosporas pueden sobrevivir una hora o mas en agua hirviendo por eso es utilizado el método de Schaeffer – fulton.
* Ejemplos de esporas que causan enfermedades (2)
1. Bacillus cereus: Intoxicación alimentaria por Bacillus cereus, este contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas pasteurizadas y especias, entreotros alimentos.
2. Clostridium botulinum: causante del botulismo, el bacilo bloquea la liberación de la sustancia acetilcolina, que es un neurotransmisor en las terminaciones nerviosas, lo que provoca la paralisis de los músculos y puede llevar a la muerte por un paro respiratorio.
3. Clostridium tetani: causante del tétano, este bacilo es anaeróbico, esta presente en la tierra sus esporas pueden entran en el organismo humano, la vía de penetración es una herida a la que no llega aire.
4. Bacillus anthracis: Antrax, enfermedad bacteriana que puede infectar a todos los animales de sangre caliente incluyendo el hombre.
* ¿Qué es un aislamiento bacteriano y para que sirve?
Es separar un tipo de microorganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. Sirve para obtener una cepa pura y poder utilizarla en pruebas, se para obtiene solo un tipo de microorganismo, así se pueden estudiar mas facilmente y en base al microorganismo aislado poder sacar conclusiones de las pruebas o experimentos realizados.

Referencias
* Braun, W. bacterial genetics, Saunders Company, Philadelphia, 1953. Exposición de la genética bacteriana.
* Dubos, Rened. Bacterial and Mycotic Infection in Man, tercera edicion. J.B. Lippicontt company, filadelfia, 1958. Otra amplia obra de consulta.
* SECCION 18: ENFERMEDADES DE LA PIEL, CAPITULO 202 Infecciones,https://www.msd.es/publicaciones/mmerck_hogar/seccion_18/seccion_18_202.html, 31 de enero de 2010
* Solo ciencia, https://www.solociencia.com/biologia/microbiologia-tecnicas.htm, 28 de enero de 2010