Métodos moleculares dependientes de cultivo

Los métodos microbiológicos tradicionales han sido de gran ayuda para identificar y clasificar microorganismos desde hace muchos años. Sin embargo, se basan en criterios fenotípicos (i.e. morfológicos, utilización de nutrientes, formación de algún metabolito, etc.) lo cual muchas veces no permite distinguir entre organismos cercanos. Los métodos moleculares, al ser basados en características genotípicas, pueden distinguir incluso entre cepas de la misma especie. Es por eso que lo mas conveniente es complementar los métodos tradicionales con los moleculares para tener un mejor panorama.
Estos métodos incluyen: perfil de plasmidos, analisis de restricción enzimatica, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), ribotipificación, electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), analisis de restricción de ADN ribosomal amplificado (ARDRA), polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y secuenciación. En todos los casos es necesario tener el microorganismo aislado para poder hacer la tipificación, por lo que es de suma importancia tener colonias puras para evitar resultados erróneos.

Existen variasaplicaciones de estas metodologías como estudios clínicos, epidemiológicos e incluso de importancia económica y de propiedad intelectual. Tal es el caso de la identificación de cepas de levadura en la producción de vinos usando RFLP y MLST para confirmar que la información de la etiqueta sea veraz y no te den “gato por liebre”. Otro ejemplo es la identificación de perlas de ostras del género Pinctada mediante RFLP. Esto tiene un impacto económico muy fuerte y ayuda a prevenir fraudes.
El uso de bioinformatica ha permitido un gran avance en estos métodos. Existe gran cantidad de software en la red para el analisis de imagenes de geles, alineamiento de secuencias y para generar arboles filogenéticos. Muchos de éstos son gratuitos, pero otros son muy caros (e.g. Quantity One de BioRad). Ademas existen bases de datos con millones de secuencias como GenBank que nos permite diseñar adecuadamente el experimento (gen de interés, primers, etc.) y comparar los resultados obtenidos.
Es importante identificar los puntos críticos de la técnica que vamos a aplicar para controlar éstos al maximo y asegurar la confiabilidad de los resultados. En el caso de la Tipificación MultiLocus de Secuencias (MLST) el punto crítico es la selección de los genes que se van aestudiar, entonces se requiere un estudio previo exhaustivo para poder obtener buenos resultados. Cuando se utilizan enzimas de restricción, es necesario seleccionarlas adecuadamente para obtener buenos resultados y en el caso de AFLP, escoger los adaptadores también es crítico.

Los principios de plataforma del movimiento de ecología profunda
1. El bienestar y florecimientode la Vida humana y no humana en la Tierra tiene valor en sí misma (sinónimo: valor intrínseco, valor inherente). Estos valores son independientes de la utilidad que tengan el mundo no-humano para los propósitos de los humanos. 2. La riqueza y diversidad de las formas humanas contribuyen a la realización de estos valores y también son valores en sí mismos. 3. Los humanos no tienen derecho a reducir la riqueza y diversidad, excepto en caso de satisfacer necesidades humanas vitales. 4. El florecimiento de la vida humana y de las culturas es compatible con una disminución sustancial de la población humana. El florecimiento de la vida no-humana requiere tal disminución. 5. La interferencia humana actual con el mundo no-humano es excesiva, y esta situación esta empeorando rapidamente. 6. Por lo tanto las políticas tienen que cambiar. Estas políticas afectan la economía
basica, y las estructuras tecnológicas e ideológicas. El resultado sera profundamente diferente a lo que sucede en el presente. 7. El cambio ideológico se refiere mas bien a una apreciación de la calidad de vida (relacionado con situaciones de valores inherentes) mas que con la adhesión a un estandar de vida cada vez mas superior. Existira una gran conciencia sobre la diferencia entre grande y gran. 8. Quienes suscriben los puntos precedentes tienen la obligación de tratar de implementar, directa o indirectamente, los cambios necesarios. (Citado de Deep Ecology de Bill Deval y George Sessions, Gibb Smith, Salt Lake City, 1985, p. 70)). Naess yotros, llaman a quienes respaldan estos ocho principios, los sostenedores del movimiento de ecología profunda. Como lo mencionabamos, Naess hace hincapié en que quienes respaldan estos principios lo pueden hacer desde los mas variados puntos de vistas fundamentales. Así como los pajaros construyen distintos tipos de nidos en diferentes habitats, así también las culturas humanas que crecen en sitios ecológicos respetando sus valores inherentes, desarrollan diversas formas de practicas, tecnologías y orden social. A veces las personas confunden 'el movimiento de ecología profunda' como ha sido definido mas arriba, con los propios principios fundamentales de filosofía ecocéntrica de Naess, o ecosofía (camino para realizar la sabiduría y la armonía ecológicas). Arne Naess, denomina su propia visión totalizadora Ecosofía T (no ecología profunda), que deriva su nombre de la cabaña (en Tvergastein) en la que desarrolló su propia y personal ecofilosofía. Es en base a la ecosofía T con lo que él personalmente apoya los principios de la plataforma del movimiento de ecología profunda. Naess intenta lograr que su visión totalizadora pueda ser estudiada planteando una norma única, ¡Auto-realización! El tuvo influencias de Spinoza, del Budismo y de Gandhi. La auto-realización se interpreta como '¡Auto-realización para todos los seres! Los puntos de exclamación son utilizados para recalcar que ésto no es una mera descripción, sino que se refiere a algo que debería suceder. Naess cree que a norma es la base de su propia ecosofía. Incita a queotros desarrollen sus propias ecosofías basadas en sus propios puntos de vistas fundamentales. La auto-realización para los humanos -dice- puede realizarse de variados modos. Su propio enfoque consiste en extender su sentido de identificación a un sentido mas amplio Otra consideración importante es el costo de la técnica que se quiere aplicar. Tanto de montaje como el uso rutinario de la misma. Algunos equipos son muy caros (e.g. RiboPrinter® de DupontTM), pero tienen la ventaja de ser 100% automatizados con lo que se elimina el error humano. La secuenciación es una herramienta mas poderosa, pero los costos eran muy elevados. Con los nuevos métodos de secuenciación masiva, éstos se han abaratado y ahora es posible secuenciar el genoma completo en poco tiempo y con poca inversión.
En conclusión, es importante tomar en cuenta el nivel de resolución que queremos (género, especie o cepa) y la inversión que se requiere para montar y aplicar la técnica. Los tradicionales nos sirven para aislar los microorganismos y, en ocasiones, para identificar a nivel de género y especie. Es bueno complementar los métodos tradicionales con mas de un método molecular, para así aumentar el poder discriminativo y comparar las técnicas entre sí.