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Métodos para la rapida detección de residuos de drogas químicas y veterinarias en el alimento animal - drogas Veterinarias y Promotores de Crecimiento, regulación internacional de farmacos de uso veterinario



1. INTRODUCCIÓN

El uso de drogas veterinarias (DV) y agentes promotores de crecimiento (APC) esta ampliamente extendido en la practica agropecuaria, tanto para propósitos terapéuticos y profilacticos, como para eficiencia improvisada de la producción. El consumado anual estimado de antimicrobianos en la Unión Europea y en los Estados Unidos es de 10 000 toneladas métricas en cada lugar. Alrededor de la mitad del total de antibióticos en los Estados Unidos son utilizados para producciones pecuarias [2].
Como consecuencia, los DV y APC pueden aparecer como residuos en el producto alimenticio final, y pueden ser incluidos en la cadena alimenticia. Por consiguiente, el consumo de productos animales (ej. carne, leche, huevo, etc.) conteniendo residuos de estos compuestos por largos periodos, es un tema de preocupación por los posibles efectos en la salud humana. A pesar de que haya sido demostrado que ciertos quimioterapéuticos pueden mostrar propiedades carcinogénicas, el principal problema esta relacionado con el posible desarrollo de resistencia bacteriana en humanos por el incontrolado consumo de residuos antibióticos. Ademas, dosis relativamente altas de estos compuestos pueden provocar reacciones alérgicas en algunos individuos hipersensibles.


Los métodos rapidos y la mecanización para la detección y caracterización de residuos de drogas veterinarias en el alimento de origen animal constituyen un area dinamica en el procesamiento de alimentos y esta experimentando importantes desarrollos fundamentalmente desde el punto de vista de la salud alimenticia. Residuos de estas sustancias pueden estar presentes en los tejidoscomestibles, leche y huevo para consumo humano, y podría ejercer diferentes niveles de toxicidad en los consumidores durante el consumo. Ademas, las pruebas (test) faciles, rapidas y sensibles son realmente necesarias para un mayor uso efectivo [10].



2. ANTECEDENTES

2.1. Drogas Veterinarias y Promotores de Crecimiento
Las drogas veterinarias y químicas que tienen efectos anabólicos son usadas, aunque la mayoría de ellos estan prohibidos en Europa, y sólo pueden ser administrados en circunstancias específicas (propósitos terapéuticos), pero bajo un estricto control [10]. Se entiende por anabólicos a sustancias capaces de incrementar la retención de nitrógeno aumentando la acumulación de proteínas en los animales. También existen otras sustancias promotoras del crecimiento, pero que al actuar por otros mecanismos no pueden considerarse anabólicos [9].
Los promotores del crecimiento incluyen una serie de sustancias muy heterogéneas entre las que destacan los antibióticos, los compuestos hormonales anabolizantes, los agentes antitiroideos, llamados finalizadores carnicos y los β-agonistas o agentes de reparto. Uno de los principales efectos de los promotores de crecimiento es el aumento de la cantidad de proteína y un descenso del contenido en grasa lo cual le da a las canales un aspecto mas magro. Esto se traduce en una mayor eficiencia del pienso aunque la carne pierda parte de su jugosidad. [7] Las principales drogas veterinarias y sustancias con efecto anabólico estan listadas en la Tabla 1.


Tabla 1. Lista de drogas veterinarias y sustancias con efectos anabólicos, con algunos ejemplos (Directiva de Consejo 96/23/CE)
Grupo A:Sustancias con efectos anabólicos Grupo B: Drogas veterinarias
1. Estilbenos (dietilestilbestrol) 1. Sustancias antibacterianas
2.
Agentes antitiroideos (tiouracilo) Sulfonamidas y quinolonas
3.
Esteroides 2. Otras drogas veterinarias
Andrógenos (Acetato de trembolona) a) Antihelmínticos
Progestagenos (Acetato de melengestrol) b) Anticoccidiostatos, incluyendo nitroimidazoles
Estrógenos (17-β-estradiol) c) Carbamatos y piretroides
4.
Lactonas del Acido Resorcílico (zeranol) d) Sedativos
5. β-agonistas (clembuterol) e) Antiinflamatorios no esteroideos
6. Otros compuestos (nitrofuranos) f) Otras sustancias farmacológicamente activas

Los promotores de crecimiento tienen efecto, improvisando el índice de conversión alimenticia, y en la calidad de la carne, usualmente en la que es de pobre calidad, donde se exhibe un incremento en la producción del tejido conectivo y trabéculas de colageno que incrementa la firmeza de la carne. Las proteasas musculares responsables de la ruptura de proteínas en el proceso postmortem son inhibidas (β-agonistas). El resultado es una reducción substancial en la ternura. Ademas, la cantidad de grasa es substancialmente reducida con la subsecuente pérdida de jugosidad, y muy pobre sabor.
2.2. Problematica del uso de sustancias promotoras del crecimiento
Algunas sustancias, como el tiouracilo, producen una notable retención de agua que es repentinamente perdida cuando se cocina la carne. El resultado es una carne mas dura con poca jugosidad. Pero aún mas importante que esto, son los efectos tóxicos importantes que estas sustancias presentan en cantidades residuales. Algunos de estos efectos songenotóxicos, inmunotóxicos, carcinogénicos o endocrinos en los consumidores, constituyendo un importante riesgo para la salud que debe ser controlado. Ademas la presencia de estos residuos deben ser monitorizados en los alimentos de origen animal.
Los antibióticos actúan como promotores de crecimiento, pero pueden contribuir al incremento de la exposición humana a los antibióticos, desarrollo de patógenos con resistencia a los antibióticos y el incremento de alergias debido a su presencia en los alimentos. De hecho, la presencia de antibióticos residuales en los alimentos de animales constituyen un importante riesgo para la salud, porque la incrementada resistencia bacteriana detectada en los últimos años. En adición, la presencia de cantidades residuales de antibióticos, produce dificultades importantes para los procesadores de alimentos para la extensión y control de la fermentación de los alimentos.

2.3. Regulación internacional de farmacos de uso veterinario
La regulación de medicamentos de uso veterinario se orienta a controlar el uso y residualidad de estas sustancias en las especies en las cuales son administradas; estos aspectos son mundialmente vigilados por diferentes organizaciones, dentro de las cuales se destacan:
a) Comisión del Codex Alimentarius: se encarga de proteger la salud de los consumidores, facilitar practicas justas en el comercio de alimentos y promover la coordinación de normas alimentarias acordadas por diversas organizaciones.
b) Programa Internacional de Seguridad de las Sustancia Q Químicas (IPCS, por sus siglas en inglés): establecido por la Organización Mundial de la Salud (OMS), la OrganizaciónInternacional del Trabajo (OIT) y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), que establece bases científicas para el uso seguro de los químicos.
c) Comité mixto FAO/OMS de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA): proporciona asesoramiento científico mediante la publicación de textos acerca de la inocuidad de los aditivos alimentarios, la evaluación de los contaminantes, las sustancias tóxicas naturales y los residuos de medicamentos veterinarios.


d) Administración de alimentos y drogas de los Estados Unidos (Food and Drug Administration - FDA): regula la fabricación y distribución de los medicamentos de uso veterinario a través del CVM (Centro de Medicina Veterinaria), protege la salud de los consumidores garantizando la seguridad de los aditivos alimentarios, productos cosméticos y medicamentos de uso humano y veterinario
e) Agencia Europea de Medicamentos (EMEA): protege y promueve la salud pública y animal mediante el establecimiento de límites de seguridad para los residuos de medicamentos veterinarios en animales productores de alimentos.
f) Autoridad Australiana en Pesticidas y Medicina Veterinaria (Australian Pesticides and Veterinary Medicines Authority - APVMA) responsable de la evaluación, registro y regulación de plaguicidas y medicamentos veterinarios [1].
g) Autoridad Europea para la Seguridad Alimentaria (EFSA, por sus siglas en inglés) que participa activamente en la evaluación del riesgo asociada a alimentos.
Tanto el Codex Alimentarius como la EMEA han elaborado su propia lista de farmacos regulados, esta incluye los límites de residuos maximos (LMRs) para cada principio activo detallando enqué especie animal (avícola, bovina, caprina, cunícola, ovina, piscícola o porcina) y tejido o subproducto de esta (leche, huevos, grasa, músculo, hígado o riñón) se establece dicho límite [5].
El uso de sustancias que tienen acción hormonal o tireostatica, como los β-agonistas estan prohibidos en la Unión Europea. Sólo unas cuantas sustancias estan autorizadas para propósito terapéutico y bajo el control del médico veterinario responsable. La presencia de estas sustancias en los alimentos son controladas por los servicios de inspección oficial y analítica que siguen la directiva CE 96/23/CE en medida de monitorear ciertas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos.

2.4. Normativas Reguladoras de la metodología analítica
Para determinar un criterio para la identificación, confirmación, y la monitorización del cumplimiento fue descrita la Directiva Consular 93/256/CEE, luego de la cual observado un claro decrecimiento en el uso de agentes promotores de crecimiento, incluyendo β-agonistas. Mas recientemente, la Comisión de Decisiones 2002/657/CE implementó la Directiva Consular 96/23/CE, viable desde el 1 de setiembre del 2002, provee reglas para los métodos analíticos que se usan en las pruebas oficiales de las muestras, y criterios comunes específicos para la interpretación de los resultados analíticos de los laboratorios de control oficiales para dichas muestras. Esta Directiva incluye conceptos como el límite de decisión (CCα) y la capacidad de detección (CCβ) para las muestras con evaluación no-complaciente. Las guías dadas por la Directiva implican el uso de instrumental analítico sofisticado como GC-MSo LC-MS . Estos controles estan basados en la detección, y aquellas muestras sospechosas no-complacientes son confirmadas a través de métodos basados en el uso de cromatografía a gas o líquida, acoplada con espectrometrías, u otras metodologías e instrumentación analítica sofisticadas, para una caracterización y confirmación mas acertada.
En el Perú, existe una Ley de Inocuidad de los Alimentos, aprobada mediante Decreto Legislativo N° 1062; así como su Reglamento, aprobado mediante Decreto Supremo N° 034-2008-AG; los cuales establecen la competencia exclusiva del SENASA en el aspecto técnico, normativo y de vigilancia en materia de inocuidad de los alimentos agropecuarios de producción y procesamiento primario destinados al consumo humano y piensos de producción nacional o extranjera [8].


3. METODOLOGÍAS DE DETECCIÓN

Al igual que las metodologías de detección para cualquier tipo de sustancia, el analisis de farmacos en alimentos de origen animal demanda costos, tiempo, equipos, reactivos y personal entrenado. Las técnicas destinadas a tal fin deben ser de facil manipulación, económicas y con las cuales se obtengan resultados en poco tiempo; ademas deben ser reproducibles, sensibles y específicas [7]. Los laboratorios de control deben de enfrentar un gran número de muestras, con una variedad de pruebas por ser analizadas en un relativo corto periodo de tiempo. En consecuencia, hay una necesidad de métodos de detección que permitan el analisis de un número de muestras tan grande, en un corto periodo de tiempo [10].
Los métodos de detección deben ser capaces de detectar un analito o clases de analitos al nivel de interés.Algunos falsos positivos (falso complaciente) son aceptables, puesto que seran submitidos a un analisis confirmatorio, pero el método debe de evitar o reducir al mínimo el número de resultados de falsos negativos (no complacientes) porque estos no van a volver a ser analizados. Los requerimientos principales para la detección de residuos en la comida de los animales como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Principales requisitos para un método de detección
Requerimientos
Facil de utilizar
Bajo costo
Alto rendimiento
Tiempo reducido y bajo costo para los resultados
Sensibilidad (no se pierde ningún positivo)
Especificidad (mínimo número de falsos positivos)

La apropiada preparación de los procesos de muestreo, especialmente cuando se trata de alimentos sólidos como la mayoría que proviene de fuente animal, esta también atrayendo la atención debido a la miniaturización de los kits y pruebas comerciales. Esta preparación de la muestra asegura una mejor sensibilidad de las pruebas de detección [10].
Otro aspecto que se debe tener en cuenta es la preparación de las muestras, en especial las correspondientes a los alimentos sólidos, ya que son pocos los kits comerciales existentes que estan diseñados para este tipo de muestras. Por lo tanto se hace necesario utilizar técnicas de extracción adecuadas que puedan asegurar mayor sensibilidad durante el analisis [5]. En general, los límites de detección van a depender de la previa extracción y limpieza de la muestra [10]. La mejora en la detección se ha visto muy influenciada por la preparación de las muestras, paso previo, que también ha sufrido un notable avance, el uso de técnicasde extracción y concentración como son la extracción en fase sólida (SPE) mediante cartuchos o columnas desechables, la extracción mediante columnas de inmunoafinidad (IAC) y el uso de polímeros de impresión molecular (MIP’s), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Otro punto fundamental consiste en conocer el metabolismo de las sustancias del grupo A y del grupo B ya que a menudo, se tienen que detectar los metabolitos de las sustancias. Las diferentes técnicas de extracción aseguraran la eliminación de las potenciales interferencias presentes en el alimento [7].

De las diferentes técnicas disponibles para la detección de residuos de farmacos en alimentos de origen animal, las mas usadas son las técnicas inmunológicas, cromatograficas y microbiológicas. Las técnicas inmunológicas mas utilizadas son ELISA, radioinmunoensayo (RIA) y biosensores. Los métodos de cromatografía principalmente consiste en dos tipos: HPTLC y HPLC, unido a diferentes métodos de detección. Las técnicas microbiológicas in vitro, particularmente aplicadas a residuos de antibióticos, son primordialmente la incubación de organismos anaerobios provenientes de heces, la determinación en cultivos bacterianos de la concentración mínima inhibitoria y la simulación de modelos intestinales [5].
Tabla 3. Lista de las principales técnicas disponibles para detección
Métodos Inmunológicos Métodos cromatograficos
Kits de ELISA Cromatografía de capa fina de alta performance (HPTLC
Radioinmunoensayo Cromatografía líquida de alta performance (HPLC)
Biosensores


4. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

La reacción antígeno anticuerpo ha sido utilizada por muchosaños para detectar una gran variedad de constituyentes el alimento, incluyendo las sustancias responsables de adulteración y contaminación.
La interacción antígeno-anticuerpo es muy específica y útil para la detección de residuos químicos y drogas veterinarias e el alimento de los animales [10].


4.1. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA
Es la técnica mas usual de este grupo, que consiste en ensayos con inmunoabsorbentes ligados a una enzima y el sistema de detección por lectura espectrofotométrica. Hay diferentes formatos para la cuantificación de antígenos [7].
En los test de ELISA de anticuerpo doble o Sandwich, un anticuerpo primario es adherido al fondo de una placa. El antígeno de la muestra extraída es adherido a los complejos del fondo del pocillo por medio de la unión antígeno-anticuerpo, y permanecen unidos después del lavado. Entonces un segundo anticuerpo marcado con una enzima como la peroxidasa es añadido al pocillo seguido de una buena lavada. La cantidad de conjugados adheridos al fondo el pocillo es detectado después de la incubación con un sustrato específico. El color aparece durante la incubación y medido con un lector de microplaca, lo cual es proporcional a la cantidad de analito que hay en la muestra [10].

En el test de ELISA competitivo directo, un anticuerpo primario es utilizado para cubrir los fondos de los pocillos, e incubado con el extracto de la muestra conteniendo los antígenos. Una vez que el equilibrio es alcanzado, un antígeno marcado con enzima es añadido. Este conjugado se ligara a los sitios libres del anticuerpo primario. Así es como, mientras mas antígeno hay en lamuestra, es menor la cantidad de uniones con antígeno marcado con enzima. El sustrato específico apropiado es añadido y la placa es incubada para la aparición del color En este caso hay una relación inversa entre el desarrollo del color y la concentración del analito en la muestra [10].


Las principales ventajas y desventajas de los kits inmunológicos estan numeradas en la Tabla 4. Estos kits ofrecen importantes ventajas como el mayor número de muestras analizadas por kit, son rapidos en la operación y su alta especifidad y sensibilidad en comparación con los métodos de detección convencionales. Otra ventaja es la posibilidad de utilizar el kit dentro del establecimiento que procesa el alimento, sin la necesidad de transportar la muestra al laboratorio. Muchas compañías de diagnóstico han desarrollado sus propios kits de prueba de ELISA para la detección de dichos residuos. Ademas, las pruebas de ELISA estan disponibles para un largo número de sustancias dentro de cada grupo listado en la Tabla 1 como los β-agonistas, corticoides, esteroides, estilbenos, lactonas del acido resorcílico y varios antibióticos. Las investigaciones para el desarrollo de un nuevo ELISA para otras sustancias como sedativos y los β-bloqueantes carazolol continúan. Tomando en cuenta los antibióticos, los kits de ELISA han demostrado un buen desempeño al analizar residuos de antibióticos como la tilosina y tetraciclina en el agua, carnes y pescados; cloranfenicol en la leche y carnes, nitromidazoles en los huevos y gallinas, gentamicina en la leche, dihidroestreptomicina y colistina en la leche, bacitracina, espiramicina, tilosina, olaquindox y virgiamycin enlos alimentos. En general, estos métodos requieren algunas veces de un manual operativo para la adición de la muestra, incubación, lavado y descarga de líquidos, reagentes para el desarrollo del color, etc. Esto ha impulsado el desarrollo de los test de ELISA automatizados por algunas compañías [10].
Tabla 4. Principales ventajas y desventajas de los kits de ELISA
Ventajas Desventajas
Facil de utilizar Costo incrementado a partir del 2002 (mas de 650€ por kit
Kits disponibles para un buen número de compuestos específicos Almacenamiento limitado (algunos meses) bajo refrigeración
Disponibilidad de kits por familia de compuestos (p.e. agonistas, estilbenos, sulfonamidas, etc.) Costoso en caso del RIA, y necesita un sitio de desechamiento
Gran número de muestras (42) por kit para un solo analito Las interferencias pueden dar algunos falsos positivos
Reducido tiempo (algunas horas) para obtener los resultados: entre 2-2.5 horas para la mayoría de los kits Solo un kit por cada búsqueda de residuo
Alta sensibilidad
Alta especificidad
Posibilidad de usar dentro del centro de fabricación de las alimentos

4.2. Radioinmunoensayo (RIA
El radioinmunoensayo (RIA) implica la medida de la radioactividad de los complejos inmunológicos utilizando un contador. Otras posibilidades incluyen la medida de la quimioluminicencia con un luminómetro, cuando un compuesto quimioluminisciente se liga al anticuerpo, o fluorescencia con un fluorímetro, cuando un compuesto fluorescente es usado. Estos permiten una detectabilidad mejorada en comparación con la convencional colorimetría [10].

Figura. Principio basico del radioinmunoensayo(Método competitivo)

4.3. Biosensores
Otras recientes aproximaciones a la observación de drogas veterinarias en los productos animales, asegurando la calidad y seguridad de la carne y productos lacteos, consiste en el desarrollo de biosensores [10].
Un biosensor se define como un dispositivo compacto de analisis que incorpora un elemento de reconocimiento biológico (acido nucleico, enzima, anticuerpo, receptor, tejido, célula) o biomimético (PIMs, aptameros, PNAs) asociado a un sistema de transducción que permite procesar la señal producida por la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito [4].

El principio de detección de un biosensor se basa en la interacción específica entre el compuesto o microorganismo de interés y el elemento de reconocimiento. Como resultado de esta unión se produce la variación de una o varias propiedades físico-químicas (pH, transferencia de electrones, de calor, cambio de potencial, de masa, variación de las propiedades ópticas, etc.) que detecta el transductor. Este sistema transforma la respuesta del elemento de reconocimiento en una señal electrónica indicativa de la presencia del analito sometido a estudio o proporcional a su concentración en la muestra [4].
Los biosensores estan siendo expandidos en la aplicación del analisis de los alimentos. En general, hay varios elementos. La construcción de biosensores requiere un buen conocimiento de los principios basicos de reacciones inmunoquímicas, rutas para la señal amplificada del receptor-base y el desempeño interfacial de biocompuestos en la superficie artificial transductora. Los biosensores estan designados para operar en el tiemporeal y ser capaces de simultaneamente poder detectar uno o varios residuos de drogas veterinarias en una muestra al mismo tiempo. Algunos autores han reportado la no necesidad de limpiar la muestra. El analisis de interacción biomolecular esta basado en la resonancia “plasmatica” superficial que mide las variaciones del índice refractario de las soluciones cercanas al sensor cuando hay cambios en la concentración de moléculas en esa solución. El residuo objetivo es covalentemente inmovilizado en la superficie del chip sensor. Esta tecnología es aplicada por Biacore AB para analizar diferentes tipos de residuos de drogas veterinarias. Algunas recientes aplicaciones incluyen progesterona en la leche y tilosina en la miel [10].
Otros biosensores estan basados en el uso de series de biochips que permiten una monitorización a tiempo real de la interacción entre el reconocimiento molecular y el analito. El reconocimiento de la señal es convertido en una señal cuantificable. Sin embargo, aún esta limitado comercialmente. Varios factores como la sensibilidad del sensor ligando superficial densidad, activan la concentración de anticuerpo, y la tasa de flujo del biosensor afecta e desempeño del ensayo [10].
Los biosensores enzimaticos utilizan una enzima específica para la captura y la generación de catalisis del producto. Por ejemplo, la penicilina V y G pueden ser detectadas con penicilasa inmovilizada en una superficie, que puede ser una membrana o un vidrio poroso, lo cual produce acido peniciloico y ademas una reducción en el pH y un decrecimiento en la intensidad de fluorecencia del teñido y/o un incremento en la conductividad eléctrica[10].
Otros tipos de biosensores estan basados en lo sensores proteínicos de antibióticos los cuales son sensibles a específicas clases de antibióticos. Estos sensores son altamente “sofisticados” y compatibles con el tipo de formato del ELISA. El biosensor proteínico esta químicamente ligado a una superficie sólida, que es el pocillo, en una placa de microtitulación, la cual, en ausencia de antibiótico, se mantiene unida a la secuencia operativa y después de la detección por anticuerpos y el emparejamiento con peroxidasa produce un color d lectura. Sin embargo, los biosensores son incapaces de unir el operador cuando el antibiótico esta presente y, dependiendo de la cantidad, este operador es mas o menos perdido en los pasos de lavado. La pérdida de color da una lectura que es proporcional a la concentración de antibiótico. Estos sensores han mostrado una detección exitosa de antibióticos como tetraciclinas, estreptograminas, macrólidos en concentraciones d nanogramo por mililitro en la leche y suero.
Las principales ventajas y desventajas de los biosensores estan enlistadas en la Tabla 5. Estas nuevas tecnologías estan teniendo una buena recepción en los laboratorios de control debido a la reducción en el tiempo total y la posibilidad de analizar simultaneamente varios residuos e un menor periodo de tiempo para un mayor número de muestras. De hecho, estas tecnologías estan totalmente automatizadas (inyección, adición de reagentes, lavado, incubación y resultados) y controladas a computadora.
Tabla 5. Principales ventajas y desventajas de los biochip biosensores
Ventajas Desventajas
Facil de utilizar Alta inversión inicial (equipo)Resultados disponibles en poco tiempo Altos costos operativos (chips)
Múltiples residuos analizados en un mismo tiempo (tanto como la cantidad de chips que haya) Analisis restringidos al número de chips que haya.
Completa automatización: mayor productividad Las interferencias pueden dar algunos falsos positivos
Técnica de alto rendimiento: hasta 120 muestras por hora. Solo un kit por cada búsqueda de residuo


5. TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA

5.1.
Concepto de la Cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación extraordinariamente versatil que presenta distintas variantes.
En toda separación cromatografica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente esta la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve rapidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho mas lenta [6].
tipo fase estacionaria fase móvil
líquido-sólido
sólido inerte como gel de sílice o alúmina
disolventes
intercambio iónico
resina cambiadora
soluciones acuosas
líquido-líquido
líquido adsorbido en un soporte sólido
líquido
gas-líquido
película de líquido adsorbida sobre un soporte sólido
gas

5.2. Cromatografia de capa fina
La cromatografíacapa-fina de alta performance ha sido aplicada con éxito para la detección cualitativa y cuantitativa de multiresiduos en muestras de comida, aunque su uso ha decrecido durante las últimas décadas. La visualización de los componentes puede ser realizada al adicionar un apropiado reagente cromogénico o bajo luz UV. La determinación cuantitativa es posible a través de la intensidad relativa del punto en la placa, la cual comparada con la del estandar interno mediante un escaner de densiometría. Recientes desarrollos permiten una automatización en forma similar al HPLC con el equipo apropiado. El HPTLC ha sido aplicado a diferentes residuos como drogas thyreostatic, clenbuterol y otros agonistas, nitromidazol y sulfonamidas en tejidos animales. También ha sido aplicado al analisis de corticosteroides y antibióticos en la leche. Los sitios pueden ser variación A, llamado TLC-autobiografía consiste en la combinación de cromatografía capa-fina con detección microbiológica directa en la placa resultando en una sensibilidad intensificada. Ha sido aplicada a la detección de “flumequina” en la leche. Las principales ventajas y desventajas del HPTLC estan enlistadas en la Tabla 6.
Tabla 6. Principales ventajas y desventajas del HPTLC
Ventajas Desventajas
Alto número de muestras para un solo analito Requiere técnicos con experiencia
Reducido tiempo (algunas horas) para obtener los resultados Necesidad de una preparación de la muestra (extracción, filtración, etc.)
Posibilidad de automatización para una mayor productividad La interferencia produce algunos falsos positivos
Sensibilidad Solo una placa de capa fina por residuo estudiado
Especificidaddependiendo de la técnica de detección
Muestras separadas pueden ser utilizadas para un analisis confirmatorio

5.3. Cromatografía líquida
El uso de cromatografía líquida de alto desarrollo (HPLC) se expandió durante 1990 y la habilidad de automatización de alguna forma facilitó su uso como una técnica de observación. El HPLC es una técnica separativa, y su habilidad de detectar compuestos depende del tipo de detector utilizado. La elección del sistema de detección es muy importante para la selectividad y la sensitividad. Algunos analitos no detectados por absorbancia, índice refractario o fluorescencia podrían requerir modificaciones químicas para volverse “cromóforos”, fluorescentes o absorbentes de UV. Usualmente la absorción de multiresiduos esta basada en una extracción y limpieza de fase sólida, seguida por filtración e inyección hacia un HPCL en fase-reversa con detección de serie por UV-diodo. Ha sido aplicado para la detección de antibióticos en carne, riñón y leche, drogas veterinarias en huevo, leche, pescado y carne, metil- tiouracilo en orina, esteroides anabólicos en suplementos nutricionales y orina y corticoesteroides como dexametasona en agua, alimento y carne. Un buen número de sustancias con propiedades anabólicas, que pueden ser consideradas como promotores de crecimiento, han sido satisfactoriamente aisladas e identificadas con propósitos de observación en la orina. El HPLC con detección de fluorescencia también ha sido utilizado para la determinación simultanea de 10 residuos antibacteriales quinolonas en múltiples especies de tejido animal. Las principales ventajas y desventajas estan listadas en la Tabla 7.Tabla 7. Principales ventajas y desventajas del HPLC
Ventajas Desventajas
Corto tiempo para obtener los resultados Requiere técnicos con experiencia
Sensibilidad Necesidad de una preparación (extracción y filtración, adicióN e un estandar interno, etc.)
Especificidad dependiendo del detector Alta inversión inicial (equipo)
Automatización guía a una mayor productividad Costo de la columna
Posibilidad de encontrar mas información de los espectros cuando se utiliza el detector diodo

El uso del HPLC esta expandiéndose en los laboratorios de control debido a la posibilidad de analizar múltiples residuos en una muestra en un relativo corto tiempo. Recientes desarrollos en el HPLC de alta velocidad puede reducir el tratamiento de la muestra y el tiempo de analisis. En adición, esta tecnología es totalmente automatizada (inyección, elución lavado de columnas, detección) y controlado a computadora, facilitando su uso como técnica de observación.
El siguiente paso después de iniciar la observación con HPLC es la inyección de las presuntas muestras positivas, en un sistema que combina el HPLC con detección por espectrometría. En este sentido, la unión del HPLC de alta velocidad con MS-MS puede sustancialmente reducir el tiempo de analisis. El uso de HPLC- ionización electrospray (ESI) espectrometría tandem ha sido propuesta como una técnica confirmatoria de observación. Otros autores han utilizado la cromatrografía espectometría líquida con ionización química por presión atmosférica (APCI) para el analisis. Ambas técnicas de ionización facilitan el analisis de pequeñas a relativamente grandes y de moléculas hidrofóbicas ahidrofílicas y son ademas muy adecuados para el analisis de residuos de drogas veterinarias. Ambas técnicas han demostrado tener efectos matrix, siendo las ESI mas susceptibles que las APCI. Otra metodología basada en la aplicación de HNMR también ha sido propuesta como una técnica de observación para el analisis de cocteles de esteroides y formulaciones de drogas veterinarias administradas hasta su acabado.
5.4. Cromatografía a gas
En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatografica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, y a diferencia de la mayoría de los tipos de cromatografia, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía gas - sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC). La cromatografía gas - líquido tiene gran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente como cromatografía de gases (GC).
La cromatografía gas - sólido se basa en una fase estacionaria sólida en la cual se produce la retención de los analitos como consecuencia de la adsorción física. La cromatografia gas - sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución con colas (una consecuencia del caracter no lineal del proceso de adsorción), de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular. Es por ello quese trata sólo brevemente en la final de este tema.
La cromatografía gas - líquido se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte. Las aplicaciones deesta técnica han crecido de una forma espectacular. Se ha estimado que unos 200 000 cromatógrafos de gases estan actualmente en uso por todo el mundo
La GC es usada con menos frecuencia en el analisis de DV y APC debido al caracter principalmente polar y soluble en agua de dichas sustancias, que requieren de tediosos pasos de derivatización. Por lo tanto, una serie de grupos de compuestos no estan incluidos en la presente sección, ya sea porque no son susceptibles al uso de GC o se prefiere métodos basados LC, sin etapas de derivatización. Los Antihelmínticos, tranquilizantes y antibióticos (excepto aminoglucósidos) no estan determinados por GC, por el contrario, los GPA, incluyendo β-agonistas y las hormonas son frecuentemente monitoreados utilizando metodologías basadas en GC [3].


6. TENDENCIAS FUTURAS

Hay varios problemas que estan surgiendo en este campo como el número aumentado de nuevas substancias en el 'mercado negro'. Todos los años, nuevas substancias con las propiedades anabólicas y con utilidad como promotores de crecimiento estan descubriéndose. Un ejemplo de la evolución de este tipo de substancias puede observarse en los altos deportes competitivos. Otro problema importante es la practica extendida que consiste en la mezcla de cantidades bajas de varias substancias, como un 'cocktail' que ejerce un efecto sinérgico, que da similar eficacia al uso de una sola substanciaa dosis mas altas y, así, detectables. Finalmente, el desarrollo de interferir las sustancias para también enmascarar los sistemas de descubrimiento del inmuno-ensayo complica el descubrimiento eficaz de las sustancias ilegales.
Ademas de estos problemas, los laboratorios de control enfrentan mas requisitos estrictos para la acción de métodos analíticos según las nuevas directivas. Esta situación esta creando algunos problemas para controlar los laboratorios debido al número grande de muestras por analizar, la gran variedad en muestras y residuos que seran analizados, la necesidad de adaptar las metodologías analíticas a las nuevas directivas con pautas estrictas, los costos aumentados para desarrollar nuevas metodologías, el número aumentado de residuos para investigar por cada muestra, y la necesidad de invertir en nuevos instrumentos mas potentes.
La disponibilidad de proyectar las metodologías facilita el control de químicos y las drogas veterinarias en los alimentos de origen animal, reduciendo el número de muestras por ser confirmadas a través de analisis confirmatorios tediosos y costosos. Los recientes nuevos desarrollos que estan disponibles en el mercado, probablemente se llevaran a cabo rutinariamente en los próximos años, aumentando el número de muestras proyectadas con alta sensibilidad. Las mejoras en la proyección de metodologías y su aplicación contribuiran a una convicción de seguridad buena de alimentos de origen animal [10].

BIBLIOGRAFÍA

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